Name: examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

저자는이 작업을 실행하는 동안 도움이 토론의 Harata 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (American Heart Association), 근긴장 의학 연구 재단, 에드워드 말린 크로, 주니어 재단, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 그리고 NCH에 화이트 홀 재단의 교부금에 의해 투자되었다

1. 포유류의 뇌에서 뉴런의 차 문화 본 연구에서 수행 된 모든 동물의 절차는 아이오와 대학의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인됩니다. <ol><li> 출생 후 0-1 일 (19, 20)에 CA3-CA1 쥐에서 해마의 영역 또는 쥐의 해리 세포 배양을 준비합니다. 24 잘 접시에 쥐 아교 공급 층으로 미리 설정 12 mm의 coverslips는 (두께 번호 0)에 12,000 세포 / 웰의 밀도로 해마 세포를 접?...

우리는 자연과 소형 시냅스 활동을 유발하고, destaining 단계에서 이미징에 대한 응답으로 시냅스 소포를 염색하고 destaining을위한 프로토콜을 설명했다. 기존 프로토콜 이외에, 우리는 미니어처 시냅스 활성에 근거 FM의 destaining 관찰의 새로운 프로토콜을 포함했다. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 이전에 운동 장애 근긴장의 마우스 모델에서 배양 된 신경 세포의 이상을 확인했다. 높은 활성 ...

시냅스 소포의 기능은 시냅스 전달의 중요한 결정 요인이다. 그들은 시냅스 세포막 (세포 외 유출)와 융합 할 때이 소포는 신경 전달 물질을 방출, 그들은 세포막 (엔도 사이토 시스)에서 재생과 신경 전달 물질로 다시로드 된 후 릴리스의 또 다른 사이클에 대한 준비가되어 있습니다. 의 역학과 시냅스 소포 재활용을 기본 메커니즘에 대한 연구는 크게 스티 FM 염료 (1)의 도입에 의해 가속화되었다. 긍정적으로 (그림 1A, 그림 1B의 FM1-43 stereoview에서 여러 염료) 친수성 머리 그룹과 소수성 꼬리가 청구 한이 양친 매성 분자는 가역적으로 입력을 침투하지 않고 지질 세포막을 종료 할 수 있습니다. FM 염료의 그룹들이 방출하는 빛의 범위에 영향을 미치는 유사한 기능을 공유 할 수 있습니다. 예를 들어, FM2-10, FM1-43, 및 FM1-84는 두 개의 고리 형 화합물과 슈 사이에 하나의 이중 결합이w 녹색 방출. 그들 사이의 차이는 소수성을 결정하고, 따라서 멤브레인으로부터 출구의 비율 (departitioning) 소수성 꼬리의 길이이다. FM5-95 및 FM4-64의 경우, 세 개의 이중 결합 사이 클릭 화합물을 연결, 그들은 적색 발광을 보여줍니다. 이 염료는 친수성 ​​부분에 대한 차이가 있습니다. 그들은 인해 친수성 ​​환경 소수성 환경 상대 양자 수율 증가, 생체막에 삽입 될 때 모든 FM 염료에서, 형광 강도가 증가한다. 따라서 FM 강도의 변화는 막 회전율의 변화를 나타냅니다. 다른 색 (발광 스펙트럼)과 hydrophobicities는 FM이 시냅스 소포 재활용의 다양한 연구 도구 염료합니다. 이러한 기능을 바탕으로, FM 염료는 대부분 시냅스 소포 재활용 분석을 다음과 같은 방식 (그림 2)에 따라 사용됩니다. 신경그들은 엔도 시토 시스 (염색)을 통해 형태로의는 시냅스 소포 (의 SV)에 채택되기에 가능, FM 염료를 포함하는 세포 외 용액에 목욕을합니다. 염료는 염료가없는 세포 외 용액을인가함으로써 세척하고, 이것은 즉 만 활발히 진행 엔도 시토 시스는 염료 (도 2 하단)으로로드 된 시냅스 소포의 클러스터를 포함 할 기능적 신경 말단을 보여준다. 이후의 세포 외 유출은 세포 외 공간으로 FM 염료의 손실과 형광의 수반하는 손실로 연결 (destaining; 인해 친수성 ​​환경에 departitioning 멀리 세포 외 유출의 사이트에서 확산 둘 다). 따라서 FM의 형광 강도의 변화는 시냅스 소포 엑소와 엔도 사이토 시스의 지표입니다. FM 염료는 다양한 생물과 준비 2,3에있는 시냅스 소포를 얼룩 destain하는 데 사용되었습니다. 예를 들면 포유류 neur 포함ONAL 문화 4-9, 포유류의 뇌 조각 10, 11, 신경 근육 접합부 (12, 13), 망막 바이폴라 뉴런 14, 15, 및 16 달팽이관의 유모 세포. 일반적으로 실험, 염색 및 destaining 모두 광범위 뉴런 (유발 활동을) 자극에 의​​해 트리거됩니다. 외부 자극 (자연과 소형 시냅스 활동) 9,17-19의 부재에서 재활용을 가지고 최근에, 그러나, 약한 자극에 대한 응답으로 시냅스 소포 재활용도 분석하고있다. 자연과 소형 시냅스 활동은 활동 전위의 자연 발화 (그림 3)을 포함하는 이전에, 외부 자극의 부재에서 발생하는 것과 같이 정의된다. 이러한 약한 시냅스 활동은 다양한 자극에 의​​해 트리거보다 FM 신호의 작은 변화와 관련되어있다. 측정을 요구하는 FM의 fluoresc의 변화줬어 강도는 정확하게 시냅스 소포 세포 외 유출 또는 엔도 시토 시스하지만 강도 인공적하지 않은 변경 사항을 반영합니다. 이슈의 원인 중 하나는 FM 염료에 의한 세포막의 비특이적 염색의 존재이다. 이 구성 요소의 점진적 유실이 잘못 시냅스 활동에 기인한다 측정 된 형광 강도의 점진적인 변화로 이어질 것입니다. 이 계수는 (프로토콜 참조) 적절한 방법에 의해 감소​​ 될 수있다. 이슈의 가장 주목할만한 원인은 시냅스 소포 내에 유지 FM 염료의 광표백입니다. FM 강도 광표백 관련된 변화를 측정하는 생물 (시냅스)의 변화에​​ 비해 작아야한다. 민감한 카메라의 최근의 개발은, 예를 들면 전자 승산 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라가 가능한 노광 시간을 단축하고 형광체를 여기 시키는데 사용되는 빛의 강도를 약화 photobleaching에 의해 최소화 할 수있다. 이슈의 또 다른 원인은 드리프트의 iN 광학 현미경의 초점 수준. 촬상 세션 동안 포커스 드리프트는 기계적 또는 열 효과에 의해 야기 될 수 있고, 잘못 측정 된 형광 강도의 변화로 이어질 것이다. 여기에서 우리는 가능한 특히, 소형 시냅스 활성, 약한 또는 전혀 자극의 컨텍스트에서 시냅스 소포 재활용을 분석하는 FM 염료를 사용할 수 있도록 프로토콜 및 장비를 설명한다. 우리는 배양 된 쥐의 해마 신경 세포를 사용하고 destaining 단계 이미징, 유발과 자발적인 시냅스 이벤트 기간 동안 소포의 염색과 destaining의 예를 보여줍니다. 또한 인하여 시냅스 활동에 대한 FM 염료 손실의 부재에서, FM 염료 광표백의 정도를 평가하는 방법을 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>This is used for assessing the cell morphology at low magnification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TiE</td>
			<td>This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. &#62;10 &#956;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXon EM+ DU-860</td>
			<td>This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid recirculating chiller</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>Oasis 160</td>
			<td>This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80&#176;C, and thereby reducing noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>CoolLED-Custom Interconnect</td>
			<td>490 nm&#160;</td>
			<td>This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Solis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-AP5</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1069</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; balanced salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td>This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities

기능 신경 말단에서 시냅스 소포는 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스를 받고있다. 이 시냅스 소포 재활용 효과적으로 막 매출을 공개 스티 FM 염료를 사용하여 분석 할 수 있습니다. FM 염료의 사용을위한 종래의 프로토콜이 자극 (유발) 시냅스 활성 다음 뉴런을 분석을 위해 설계되었다. 최근 프로토콜은 자연 또는 소형 시냅스 이벤트와 같은 약한 시냅스 활동을 함께 FM 신호 분석을위한 유효하게되었다. FM 신호의 이러한 작은 변화의 분석 영상 시스템은 강도의 작은 변화를 감지하기에 충분히 민감하다, 그러나 큰 진폭의 인공적인 변화가 억제되어 있어야합니다. 여기서 우리는, 유발 자발 및 미니어처 시냅스 활동, 예를 들어 배양 된 해마 뉴런을 사용하여 적용 할 수있는 프로토콜을 설명한다. 이것은 중요하다으로서이 프로토콜은 또한, FM 염료의 광표백의 속도를 평가하는 수단을 포함강도의 작은 변화 이미징 유물의 소스.

예를 들어, 우리는 시냅스 소포의 destaining 시간 코스 (그림 4)에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 배양 된 해마의 신경 세포가 자발적 시냅스 활동 (단계 2.3)를 사용하여 FM4-64로 염색 및 염료 무료 솔루션 (솔루션 2 린스)로 세척 하였다. 영상은 자발적인 활동 (단계 5.3) (연속 라인의 초기 부분, 그림 4A)를 사용하여 초기 destaining 시간의 과정을 보여줍니다. 이것은 120 초 동...

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Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Research

Education

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Neuroscience

Cellular Processes

Membranes and Cellular Transport

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

연구

신경과학

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

불연속 자당 구배를 사용 시냅틱 세포막과 시냅스 밀도 단백질의 제조

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

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