Name: examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

Forfatterne takker medlemmene av Harata lab for nyttige diskusjoner gjennom hele gjennomføringen av dette arbeidet. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra American Heart Association, Dystoni Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr Foundation, National Science Foundation, og Whitehall Foundation til NCH

En. Primær Culture av nerveceller fra pattedyrhjernen Alle dyr prosedyrer utført i denne studien er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Iowa. <ol><li> Klargjør dissociated cellekultur av CA3-CA1 regioner i hippocampus fra mus eller rotter dager etter fødsel 0-1 19,20. Plate de hippocampus celler på 12-mm dekkglass (tykkelse nummer 0) preseeded med rotte glial matersjikt, i 24-brønn retter, og ved en densitet på 12.000 celler / brønn. <...

Vi har beskrevet protokoller for farging og avfarging synaptiske vesikler som reaksjon på fremkalt, spontan og miniatyr-synaptisk aktivitet, og for avbildning under avfarging fase. I tillegg til de eksisterende protokoller, har vi inkludert en ny protokoll for å observere FM avfarging basert på miniatyr synaptiske aktivitet. Ved hjelp av disse protokollene, vi tidligere identifisert avvik i dyrkede nerveceller fra en mus modell av bevegelse lidelse dystoni. I forhold til sine kolleger i villtype mus, gjennomgikk diss...

Funksjonaliteten av synaptiske vesikler er en viktig determinant av synaptisk transmisjon. Disse vesikler slipper nevrotransmittere når de smelter sammen med den presynaptiske plasmamembran (eksocytose), og de blir klar for en ny syklus av utgivelsen etter å ha blitt regenerert fra plasmamembranen (endocytose) og lastes med nevrotransmitter. Forskning på dynamikken i og mekanismene bak synaptisk vesikkel gjenvinning har blitt kraftig fremskyndet av innføringen av styryl FM fargestoffer en. Disse amphipathic molekyler, som har positivt ladede vanntiltrekkende leder grupper og hydrofobe haler (flere fargestoffer i figur 1A, stereoview av FM1-43 i figur 1B), kan reversibelt inn og ut lipid membraner uten gjennomsyre dem. Grupper av FM fargestoffer dele lignende funksjoner som påvirker omfanget av lys som de slipper ut. For eksempel, FM2-10, FM1-43, og FM1-84 har en dobbeltbinding mellom to cykliske forbindelser og show grønn utslipp. Forskjellen mellom dem er lengden av den hydrofobe halen, som bestemmer dens hydrofobisitet og dermed hastigheten av utgangen fra membranen (departitioning). I de tilfeller av FM5-95 og FM4-64, tre dobbeltbindinger koble de sykliske forbindelser, og de viser røde utslipp. Disse fargestoffer forskjellige med hensyn til sine hydrofile deler. I alle FM-fargestoffer, øker fluorescensintensiteten når de blir satt inn i biologiske membraner, på grunn av en økning i kvanteutbytte i det hydrofobe miljø i forhold til det hydrofile miljø. Dermed endringene i FM intensitet representerer endringene i membranen omsetning. De ulike fargene (utslipp spektra) og hydrofobisiteter gjør FM fargestoffer en allsidig forskningsverktøy i synaptisk vesikkel resirkulering. Basert på disse funksjonene, er FM-fargestoffer for det meste brukt i henhold til følgende skjema når analysere synaptisk vesikkel gjenvinning (figur 2). Neurons er badet i et ekstracellulært løsning som inneholder FM fargestoff, slik at det å bli tatt opp i synaptiske vesikler (SVS) som de danner via endocytose (flekker). Fargestoffet blir deretter vasket ut ved å anvende et fargestoff-fritt ekstracellulær løsning, og dette viser de funksjonelle nerveterminaler, dvs. bare de aktivt gjennomgår endocytose vil inneholde en klynge av synaptiske vesikler som er lastet med fargestoffet (figur 2 på undersiden). Etterfølgende eksocytose fører til tap av FM fargestoff til ekstracellulære rom og en samtidig tap av fluorescens (avfarging, på grunn av både departitioning til en hydrofil miljø og diffusjon bort fra stedet av eksocytose). Derfor endringene i FM fluorescens intensitet er indikatorer på synaptisk vesikkel exo-og endocytose. FM fargestoffer har blitt brukt til å farge og destain de synaptiske vesikler i ulike organismer og preparater 2,3. Eksempler inkluderer pattedyr neuronal kulturer 4-9, pattedyr hjernen skiver 10,11, nevromuskulære veikryss 12,13, retinal bipolare nevroner 14,15, og hårcellene i cochlea 16. Typisk i slike forsøk, blir både farging og avfarging utløst av stor utstrekning å stimulere nervecellene (fremkalt aktivitet). Nylig har imidlertid synaptisk vesikkel gjenvinning i respons til svak stimulering har også blitt analysert, som har resirkulering i fravær av en ekstern stimulus (spontan og miniatyr-synaptisk aktivitet) 9,17-19. Spontane og miniatyr synaptiske aktiviteter er definert som de som forekommer i fravær av eksterne stimuli, med den tidligere involverer spontan avfyring av aksjonspotensialer (figur 3). Disse svake synaptiske aktiviteter er forbundet med mindre endringer i FM-signaler enn de som utløses av omfattende stimulering. Målingen krever at endringene i FM fluorescerendeence intensitet nøyaktig reflektere synaptisk vesikkel eksocytose eller endocytose men ikke kunstig endringer i intensitet. En årsak til at gjenstanden er tilstedeværelsen av ikke-spesifikk farging av plasmamembranen av FM-fargestoffer. Gradvis utvasking av denne komponenten vil føre til en gradvis endring i den målte fluorescens intensitet, som vil bli feilaktig tilskrives synaptisk aktivitet. Denne faktoren kan reduseres ved hjelp av egnede metoder (se Protocol). Det mest bemerkelsesverdige årsaken til gjenstanden er fotobleking av FM fargestoff beholdes i synaptiske vesikler. De fotobleking relaterte endringer i FM intensitet må være liten i forhold til de biologiske (synaptic) endringer som er målt. Den siste utviklingen av følsomme kameraer, f.eks elektron-multiplisere charge-coupled device (EMCCD) kamera, som gjør det mulig å minimalisere fotobleking ved å korte eksponeringstid og svekke intensiteten til lyset som brukes for å eksitere fluoroforen. En annen årsak til gjenstanden er en drift in fokuserings nivå av lysmikroskop. Fokuset drift under en avbildning sesjon kan være forårsaket av mekaniske eller termiske effekter, og vil feilaktig føre til en endring i den målte fluorescens intensitet. Her beskriver vi protokoller og utstyr som gjør det mulig å bruke FM-fargestoffer for å analysere synaptiske vesikkel resirkulering til og i sammenheng med svak eller ingen stimulering, særlig miniatyr synaptisk aktivitet. Vi viser eksempler på farging og avfarging av vesikler under fremkalt og spontane synaptiske hendelser, bruk av kultur gnager hippocampus nevroner, og bildebehandling avfarging fasen. Vi viser også hvordan man skal vurdere graden av FM fargestoff fotobleking, i fravær av en hvilken som helst FM fargestoff tap på grunn av synaptisk aktivitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>This is used for assessing the cell morphology at low magnification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TiE</td>
			<td>This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. &#62;10 &#956;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXon EM+ DU-860</td>
			<td>This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid recirculating chiller</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>Oasis 160</td>
			<td>This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80&#176;C, and thereby reducing noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>CoolLED-Custom Interconnect</td>
			<td>490 nm&#160;</td>
			<td>This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Solis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-AP5</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1069</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; balanced salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td>This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities

Synaptiske vesikler i funksjonelle nerveterminaler gjennomgå eksocytose og endocytose. Dette synaptisk vesikkel gjenvinning kan være effektivt analysert ved hjelp styryl FM fargestoffer, som avslører membran omsetning. Konvensjonelle protokoller for bruk av FM-fargestoffer ble designet for å analysere nevroner følgende stimulert (fremkalt) synaptiske aktivitet. Nylig har protokoller blir tilgjengelige for å analysere FM-signaler som følger svakere synaptiske aktiviteter, for eksempel spontane eller miniatyr synaptiske hendelser. Analyse av disse små endringer i FM-signaler krever at avbildningssystem er tilstrekkelig følsomt til å detektere små forandringer i intensiteten, men at kunstig endring av stor amplitude undertrykkes. Her beskriver vi en protokoll som kan brukes til å fremkalt, spontan, og miniatyr synaptiske aktiviteter, og bruke dyrkede hippocampus nevroner som et eksempel. Denne protokollen inneholder også et middel for å vurdere graden av fotobleking av FM-fargestoffer, da dette er en betydeligkilde av gjenstander når imaging små endringer i intensitet.

Som et eksempel kan vi vise representative resultater for avfarging tidsforløpet av synaptiske vesikler (Fig. 4). Dyrkede hippocampus-neuroner ble farget med FM4-64 ved hjelp av den spontane synaptisk aktivitet (trinn 2.3) og vasket med fargestoff-fri løsning (Renseoppløsning 2). Den avbildning viser den innledende avfarging tidsforløpet ved hjelp av spontan aktivitet (trinn 5.3) (første del av kontinuerlig linje, figur 4A). Dette blir etterfulgt av avfarging tidsforløpet ved hjel...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Undersøkelse av Synaptic Vesikkel Recycling Bruke FM Fargestoffer Under fremkalt, spontan, og miniatyr Synaptic Aktiviteter

Vi beskriver bruk av styryl FM fargestoffer til bilde synaptisk vesikkel gjenvinning i funksjonelle nerveterminaler. Denne protokoll kan anvendes ikke bare for å fremkalt, men også spontan og miniatyr synaptiske aktiviteter. Protokollen utvider rekke synaptiske hendelser som kan effektivt evaluert.

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Cellular Processes

Membranes and Cellular Transport

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analyse av Synaptic vesicle Pool Etterfylling i Cultured lillehjernen Granule Neurons bruker FM Fargestoffer

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusjon og eksocytose av membran proteiner i dyrkede Neurons vurdert ved hjelp av Fluorescens Recovery og fluorescens-tap photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Utlede Tid Course of Glutamat Lagersalg med en deconvolution Analyse av astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Utarbeidelse av Synaptic Plasma Membran og postsynaptiske Density Proteiner Ved hjelp av en Discontinuous sukrosegradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Måle Synaptic Vesicle endocytose i kulturperler hippocampus nerveceller

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Innspillingen synaptiske plastisitet i akutt hippocampus skiver vedlikeholdes i en liten volum resirkulering-, perfusjon og neddykking-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Dyrking i Vivo-liker Murine astrocyttene ved hjelp av rask, enkel og rimelig AWESAM-protokollen

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole-indusert Kindling musemodell

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Kombinere Optogenetics med kunstig microRNAs å karakterisere effekter av Gene Knockdown Presynaptic funksjonen i intakt nevrale kretser

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...