Name: examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

Авторы выражают благодарность членам лаборатории Harata за полезные обсуждения по всему исполнения этой работы. Эта работа финансировалась за счет грантов от Американской ассоциации сердца, Медицинский исследовательский фонд дистония, Эдвард Mallinckrodt, младший Foundation, Национальный научный фонд, а Уайтхолл Foundation в NCH

1. Первичная культура нейронов от млекопитающих мозг Все животные процедуры, выполняемые в данном исследовании утверждаются Институциональная уходу и использованию животных комитета в Университете штата Айова по. <ol><li> Подготовьте диссоциированную клеточную культур...

Мы описали протоколы для окрашивания и обесцвечивани синаптических пузырьков в ответ на вызванные, спонтанное и миниатюрный синаптической активности, и для работы с изображениями на этапе обесцвечивани. В дополнение к существующим протоколам, мы включили новый протокол наблюдения о?...

Функциональность синаптических пузырьков является важным фактором, определяющим синаптической передачи. Эти пузырьки выпустить нейротрансмиттеров, когда они сливаются с пресинаптической мембраны плазмы (экзоцитоза), и они становятся готовы к следующему циклу выпуска после возрождается из плазматической мембраны (эндоцитоза) и перезагружается нейромедиатора. Исследование динамики и механизмов, лежащих в основе синаптической переработки пузырьков была значительно ускорен путем введения стирил FM красителей 1. Эти амфипатические молекулы, которые положительно заряженные гидрофильные группы головы и гидрофобные хвосты (несколько красителей на фиг.1А, stereoview из FM1-43 в рисунке 1b), может обратимо входить и выходить из липидные мембраны без проникая их. Группы FM красителей имеют сходные черты, которые влияют на выбор света, который они излучают. Например, FM2-10, FM1-43, и FM1-84 имеют одну двойную связь между двумя циклических соединений и шож зеленый выбросов. Различие между ними есть длина гидрофобной хвоста, который определяет его гидрофобности и поэтому скорость выхода из мембраны (departitioning). В случаях FM5-95 и FM4-64, три двойные связи связать циклические соединения, и они показывают красного излучения. Эти красители отличаются в отношении их гидрофильных частей. Во всех FM красителей, интенсивность флуоресценции возрастает, когда они вставляются в биологические мембраны, в связи с увеличением квантового выхода в гидрофобной среде по отношению к гидрофильной среде. Таким образом, изменения в интенсивности FM представляют изменения в обороте мембраны. Различные цвета (спектры излучения) и гидрофобностей сделать FM красители универсальный исследовательский инструмент в синаптической переработки пузырьков. Исходя из этих особенностей, то FM красители в основном используются в соответствии со следующей схемой при анализе синаптической переработки везикул (рис. 2). Нейронс купаются в внеклеточного раствора, содержащего FM красителя, что позволяет ему быть взят на синаптических пузырьков (SVS), поскольку они формируют с помощью эндоцитоза (окрашивание). Краситель затем вымываются нанесением раствора внеклеточный красителей; это показывает, функциональные нервные окончания, т.е. только тех, кто активно проходит эндоцитоз будет содержать кластер синаптических пузырьков, которые загружаются с красителем (рис. 2 внизу). После экзоцитоз приводит к потере красителя FM во внеклеточное пространство и сопутствующей потерей флуоресценции (обесцвечивани; как за счет departitioning к гидрофильной среде и диффузии вдали от места экзоцитоза). Поэтому изменения в интенсивности флуоресценции FM являются индикаторами синаптических пузырьков экзо-и эндоцитоза. FM красители были использованы для окрашивания и destain синаптические везикулы в различных организмов и препаратов 2,3. Примеры включают Neur млекопитающихрных культуры 4-9, млекопитающих ломтики мозга 10,11, нервно-мышечных синапсах 12,13, сетчатки биполярные нейроны 14,15 и волосковые клетки улитки 16. Как правило, в таких экспериментах, как окрашивание и обесцвечивани вызваны широко стимулируя нейроны (вызывали активности). Однако в последнее время синаптической переработки пузырьков в ответ на слабый стимуляции также были проанализированы, как и утилизации в отсутствие внешнего стимула (спонтанное и миниатюрный синаптической активности) 9,17-19. Спонтанные и миниатюрные синаптические деятельности определяются как те, которые происходят в отсутствие внешних раздражителей, с бывшим участием спонтанное стрельбу из потенциалов действия (рис. 3). Эти слабые синаптические действия, связанные с небольших изменений в ЧМ-сигналов, чем те, вызваны обширной стимуляции. Измерение требует, чтобы изменения в FM fluorescИнтенсивность ENCE точно отражают синаптических пузырьков экзоцитоза или эндоцитоз, но не артефактом изменения в интенсивности. Одной из причин артефакта является наличие неспецифическое окрашивание плазматической мембраны ЧМ красителей. Постепенное вымывание этого компонента приведет к постепенному изменению измеряемой интенсивности флуоресценции, который будет ошибочно приписывают синаптических деятельности. Этот фактор может быть уменьшена с помощью соответствующих методов (см. протокол). Наиболее заметным причиной артефакта является фотообесцвечивания FM красителя сохраняется в синаптических пузырьков. Изменения Фотообесцвечивания связанных в FM интенсивности должно быть мало по сравнению с биологическими (синаптических) изменений, которые оцениваются. Недавнее развитие чувствительных камер, например, электрон-умножения прибор с зарядовой связью (EMCCD) камеры, позволяет свести к минимуму фотообесцвечивания за счет сокращения времени экспозиции и ослабление интенсивности света, используемого для возбуждения флуорофора. Еще одной причиной артефакта является дрейф ян фокусировки уровень светового микроскопа. В центре дрейф во время сеанса изображения может быть вызвано механическими или термическими эффектами, и будет ошибочно привести к изменению интенсивности флуоресценции, измеренной. Здесь мы описываем протоколы и оборудование, которые делают возможным использование FM красителей для анализа синаптической переработки везикул даже в контексте слабой или вообще без стимуляции, в частности, миниатюрные синаптической активности. Мы показываем примеры окрашивания и обесцвечивани пузырьков во время вызвала и спонтанных синаптических событий, используя культивируемых нейронов гиппокампа грызунов, и отображения фазы обесцвечивани. Мы также продемонстрируем, как оценить степень фотообесцвечивания красителя FM, в отсутствие каких-либо потерь FM красителя из-за синаптических деятельности.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>This is used for assessing the cell morphology at low magnification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TiE</td>
			<td>This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. &#62;10 &#956;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXon EM+ DU-860</td>
			<td>This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid recirculating chiller</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>Oasis 160</td>
			<td>This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80&#176;C, and thereby reducing noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>CoolLED-Custom Interconnect</td>
			<td>490 nm&#160;</td>
			<td>This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Solis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-AP5</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1069</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; balanced salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td>This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities

Синаптические пузырьки в функциональных нервных окончаний пройти экзоцитоза и эндоцитоза. Это синаптической переработки пузырьков может быть эффективно проанализированы с использованием стирил FM красители, которые показывают оборот мембраны. Обычные протоколы для использования FM красителей были разработаны для анализа нейроны следующее стимулированного (вызывали) синаптической активности. В последнее время протоколы стали доступны для анализа FM сигналы, которые сопровождают более слабые синаптические мероприятия, такие как спонтанных или декоративные синаптических событий. Анализ этих небольших изменений в ЧМ-сигналов требует, чтобы система визуализации достаточно чувствительным, чтобы обнаружить небольшие изменения в интенсивности, пока что артефактом изменения большой амплитуды подавлены. Здесь мы опишем протокол, который может быть применен к вызывали, спонтанный, и миниатюрные синаптические деятельности, и использовать культивированный нейронов гиппокампа в качестве примера. Этот протокол также включает в себя средство оценки темпов фотообесцвечивания FM красителей, так как это является важнымисточником артефактов при визуализации небольшие изменения в интенсивности.

В качестве примера, мы покажем репрезентативные результаты для обесцвечивани времени конечно синаптических пузырьков (рис. 4). Культивированный нейронов гиппокампа окрашивали FM4-64 с помощью спонтанного синаптической активности (шаг 2.3) и промывают раствором красителя без (пол...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Экспертиза синаптических пузырьков переработка Использование FM Красители Во вызвали, спонтанный, и миниатюрных Synaptic деятельности

Мы описали использование стирил FM красителей к фотографиям синаптической переработки пузырьков в функциональных нервных окончаний. Этот протокол может быть применен не только к вызвала, но и спонтанным и миниатюрные синаптические деятельности. Протокол расширяет множество синаптических событий, которые могут быть эффективно оценены.

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Cellular Processes

Membranes and Cellular Transport

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Изучение Synaptic Бассейны пузырьков использованием фотопревращения стириловых красителей

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Боковая диффузия и экзоцитоз мембранных белков в культивируемых нейронов оценивали по флуоресценции и флуоресценции восстановления потерь фотообесцвечивания

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Подготовка Synaptic плазматической мембраны и Постсинаптических белков плотности с использованием разрывной градиента сахарозы

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Измеряя эндоцитоза синаптических пузырьков в культивированный Нейроны гиппокампа

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Культивирование в естественных условиях-как мышиных астроциты, используя протокол быстрый, простой и недорогой AWESAM

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Модель Pentylenetetrazole индуцированной растопку мыши

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Сочетание Оптогенетика с искусственных микроРНК охарактеризовать последствия нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...