Name: generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door The Will en Jeanne Caldwell Endowed Research Fund van het University of Michigan Comprehensive Cancer Center en gedeeltelijk door NIH grant CA82529 en de Gillson Longenbaugh Foundation.

1. ALDEFLUOR-kleuring
<ol><li>Voorbereiding van celmonsters: Bereid eencellige suspensie van tumorcellen voor, hetzij uit gekweekte tumorcellen, hetzij uit vers geoogste tumormonsters. Tel de cellen en pas de celsuspensie aan tot een concentratie van 1 x10 6 cellen/ml in ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>Label vier 12 mm x 75 mm polystyreen reageerbuizen als reageerbuizen als volgt: #1: Niet vastgehouden, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR plus DEAB, en #4: 7AAD.</li>
	<li>Plaats voor deze stuurbuizen 1 ml celsuspensie in #1 en #4, maar 2 ml in buis #2. Voeg 5 μl DEAB (ALDH-remmer) toe aan de buis #3 en houd het ijs vast. Voeg vervolgens 10 μl geactiveerd ALDEFLUOR-substraat toe aan buis #2, meng en breng onmiddellijk 1 ml van het mengsel over op buis #3.</li>
	<li>Voeg tegelijkertijd 2 μl geactiveerd ALDEFLUOR-substraat per miljoen cellen toe aan de rest van de cellen (monsterbuizen) ook bij 1 x 106 cellen/ml in ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>Incubeer zowel de 4 controlebuizen als de monsterbuizen gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.</li>
	<li>Voeg na incubatie 5 μl 7AAD toe aan de controlebuis #4 en 1 μl 7AAD 1 x 106 cellen aan de monsterbuis. Incubeer 10 min bij 4 °C.</li>
	<li>Centrifugeer alle buizen gedurende 5 min op 250 x g en verwijder supernatant.</li>
	<li>Resuspend cellen in ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>Voer op flowcytometrie gebaseerde sortering uit.</li>
	<li>Stel de sorteerpoorten in met aldefluor-gebeitst cellen die met DEAB zijn behandeld als negatieve controle en de propidiumjodide (PI) 7AAD-cellen voor levensvatbaarheidscontrole. Op basis van deze controles werd een poort opgericht om de ALDEFLUOR+/ALDHhoge,D5- en SCC7-cellen te onderscheiden. Deze poorten zullen vervolgens worden gebruikt om alle hierboven voorbereide monstercellen voor de ALDEFLUOR+/ALDHhoge D5- en SCC7-cellen te sorteren.</li>
</ol>2. Bereiding van kankerstamcel Lysaat-pulse Dendritic Cell (CSC-TPDC) Vaccin
<ol><li>Euthanaseer muizen (respectievelijk syngeneïsche B6 en C3H) met behulp van CO2 en isoleer dijbeen- en scheenbeenderen.</li>
	<li>Doe de botten 1 minuut in 75% ethanol bij kamertemperatuur. Was vervolgens de botten met HBSS.</li>
	<li>Snijd de botten af en gebruik een naald van 21 G en een spuit van 10 ml om cellen in een schaal te duwen.</li>
	<li>Aspireer en blaas de cellen met behulp van de spuit om de eencellige suspensie te maken.</li>
	<li>Gooi na centrifugeren in 1500 tpm gedurende 5 minuten het supernatant weg. Voeg vervolgens 5 ml RBC-lysisbuffer toe om de RBC gedurende 1 min in 37 °C waterbad te laten lyseren.</li>
	<li>Tel het celnummer en pas de celsuspensie aan tot een concentratie van 1 miljoen cellen/ml in volledig medium (CM) met 10 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Kweek de cellen en compenseer CM plus IL-4 en GM-CSF 3 dagen later.</li>
	<li>Oogst op de 5e dag deonrijpe dendritische cellen (DC's) en bereid het DC-isolatiemedium voor dat 4,2 ml oplossing C plus 1 ml OptiPrep-dichtheidsgradiëntmedium bevat.</li>
	<li>Hang de celkorrels op in 5 ml CM. Voeg de celsuspensie langzaam toe aan het isolatiemedium. Centrifugeer bij 2.000 tpm bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verzamel de DC's tussen de CM en het isolatiemedium. Tel het celnummer en pas de celsuspensie aan tot een concentratie van 1 miljoen cellen/ml in kweekmedium dat 10 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4 bevat.</li>
	<li>Bereid tumorlysaten voor doorALDH-cellen hoog of ongesorteerd D5- of SCC7-cellen op te schorten in kweekmedium en vier keer te onderwerpen aan snelle blootstelling aan bevriezing en dooi, gevolgd door een spin van ∼ 100 x g gedurende 5 minuten om het membraangedeelte van de lysaten te verzamelen.</li>
	<li>Om CSC-TPDC voor te bereiden, pulseer DC's met het lysaat van autologeALDH-hoge cellen. Om H-TPDC voor te bereiden, pulseer DC's met ongesorteerd heterogeen tumorcellysaat. De verhouding tussen DC en tumorcellysaat is hetzelfde.</li>
</ol>3. Vaccinatie en evaluatie van de werkzaamheid
<ol><li>Vaccineer normale B6-muizen respectievelijk met 2.500 D5 CSC-TPDC of D5 H-TPDC tumorcellen subcutaan (s.c.). Vaccineer normale C3H-dieren.c. met respectievelijk 5.000 SCC7 CSC-TPDC- of SCC7 H-TPDC-tumorcellen.</li>
	<li>Daag na vaccinatie de B6-muizen uit met de heterogene D5-tumorcellen i.v.m. Euthanaseer de muizen 20 dagen later met CO2. Oogst de longen enumreer longmetastasen.</li>
	<li>Daag in het SCC7-model de C3H-muizen uit met ongesorteerde SCC7-tumorcellen.c aan de andere kant van het DC-vaccin. Controleer de tumorgrootte.</li>
	<li>Aan het einde van de experimenten euthanaseren de B6- en C3H-muizen met CO2. Op dag 34 na het eerste vaccin euthanaseer muizen met CO2en verzamel tegelijkertijd de milt van elke groep met een aseptische procedure.</li>
	<li>Activeer milt T- en/of B-cellen met geïmmobiliseerde anti-CD3 plus anti-CD28 mAbs in CM die hrIL-2 of LPS plus anti-CD40 (FGK45) mAb ascites bevatten.</li>
	<li>Verzamel na activering supernatanten en gebruik ze voor ELISA-test.</li>
	<li>Voor ELISA-test, laagplaten met antilichamen voor IFNγ, GM-CSF en IgG bij 4 °C O/N.</li>
	<li>Voeg na het aanbrengen van de blokkeerbuffer monsters en normen toe en incubeer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de plaat en voeg HRP-detectieantilichaam en TMB-substraat toe voor incubatie.</li>
	<li>Meet de absorptie op een ELISA-plaatlezer op 450 nm binnen 30 minuten na het stoppen van de reactie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

STEMCELL Technologies heeft open access publicatiekosten ondersteund.

De immunocompromitteerde gastheren, zoals SCID-muizen, sluiten immunologische beoordelingen van CSC's uit vanwege het gebrek aan adaptieve immuniteit binnen de gastheren. In deze studie evalueerden we de immunogeniciteit van CSC's in immunocompetente hosts, die de patiëntinstellingen beter zouden kunnen nabootsen. Verrijkte CSC's zijn immunogeen en kunnen een effectievere tumorbeschermende immuniteit veroorzaken wanneer hun lysaten als vaccin in DCs worden geladen in vergelijking met niet-geselecteerde tumorcellysaatgepulseerde DC's.  Mechanistisch werd de bescherming verleend door selectieve inductie van CSC-reactieve antilichamen en T-cellen8, evenals de productie van type 1-cytokine, bijvoorbeeld IFNγ en GM-CSF.
De meeste van de huidige immunotherapieën, waaronder dendritische celgebaseerde vaccins en de adoptieve T-celoverdracht, zijn ontworpen om tumorgedifferentieerde antigenen aan te pakken. CSC's, die deze gedifferentieerde antigenen niet kunnen uitdrukken, kunnen daarom aan deze immunologische targeting ontsnappen. Daarentegen kan het CSC-vaccin dat specifiek is ontworpen om zich te richten op kankerstamcellen deze speciale populatie van de kankercellen vernietigen en zo de therapeutische werkzaamheid van het vaccin verbeteren door tumorrecidief en metastase te voorkomen.
In zowel gekweekte tumorcellen als vers geoogste tumoren identificeerden we CSC-verrijkte populatie door flowcytometrie op basis van hoge aldehydedehydrogenase-activiteit. DergelijkeALDH-hoge cellen kunnen worden geïsoleerd door stroomsortering om te worden gebruikt als een antigeenbron om DC te pulseren om CSC-TPDC's te genereren. Vergelijking met ALDH-hoge cellen geïsoleerd uit gekweekte tumorcellen versus van vers geoogste tumoren toonde geen significant verschil in termijn van de inductie van anti-CSC-immuniteit8. Deze resultaten onthulden het potentieel om CSC's te gebruiken die geïsoleerd zijn van gekweekte tumorcellen of van vers geoogste tumoren voor klinische toepassing.
Om klinisch relevant te zijn, moet een vaccin in een therapeutische setting worden onderzocht. Deze experimenten worden nu uitgevoerd in ons laboratorium.

Kankerstamcellen zijn relatief resistent tegen conventionele chemotherapie en radiotherapie1,2. Aan de andere kant kan deze populatie cellen de cellen zijn die verantwoordelijk zijn voor de terugval en progressie van kankers na traditionele kankertherapieën1-4. Vanwege het gebrek aan expressie van gedifferentieerde tumorantigenen op kankerstamcellen, kunnen kankerstamcellen ontsnappen aan de huidige immunologische interventies van therapie voor kanker, die meestal zijn ontworpen om de antigenen op de gedifferentieerde tumorcellen te richten. Daarom kan de ontwikkeling van nieuwe strategieën die specifiek gericht zijn op en vernietigen van de kankerstamcellen beloften bevatten om de therapeutische effectiviteit van de huidige kankerbehandeling te verhogen. Hiertoe hebben we met kankerstamcel (CSC) verrijkte populaties geïsoleerd uit twee dierlijke tumoren (melanoom D5 en plaveiselcelkanker SCC7) en gebruikten we ze als een antigeenbron om antigeen presenterende cellen (dendritische cellen, DC) te pulseren om het CSC-TPDC-vaccin voor te bereiden. Vervolgens evalueerden we de antitumorimmuniteit geïnduceerd door het CSC-TPDC-vaccin in respectievelijk de syngeneïsche immunocompetente gastheren, B6-muizen en C3H-muizen. De CSC-TPDC-geïnduceerde antitumor werkzaamheid werd vergeleken met het traditionele DC-vaccin gepulseerd met lysaat uit ongesorteerde heterogene tumorcellen (H-TPDC), die eerder is gebruikt door onze groep5,6, evenals door andere onderzoekers7, zowel in preklinische studies als in klinische studies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

We identificeerden kankerstamcel (CSC)-verrijkte populaties van murien melanoom D5 syngeneïsche tot C57BL/6 muizen en de plaveiselkanker SCC7 syngeneic tot C3H muizen met ALDEFLUOR/ALDH als marker, en testten hun immunogeniciteit met behulp van het cellysaat als een bron van antigenen om dendritische cellen (DC's) te pulseren. DC's gepulseerd met ALDHhoge CSC lysaten veroorzaakten significant hogere beschermende antitumor immuniteit dan DC's gepulseerd met de lysaten van ongesorteerde hele tumorcellysaten in beide modellen en in een longmetastase instelling en een s.c. tumorgroeiinstelling, respectievelijk. Dit fenomeen was te wijten aan CSC vaccin-geïnduceerde humorale en cellulaire anti-CSC reacties. Met name splenocyten geïsoleerd van de gastheer onderworpen aan CSC-DC-vaccin produceerden significant hogere hoeveelheid IFNγ en GM-CSF dan splenocyten geïsoleerd van de gastheer die werd blootgesteld aan ongesorteerd tumorcellysaat gepulseerd-DC-vaccin. Deze resultaten ondersteunen de inspanningen om een autologe CSC-gebaseerde therapeutische vaccin te ontwikkelen voor klinisch gebruik in een adjuvante setting.

ALDEFLUOR/ALDH is gebruikt als een enkele marker om stamcellen te isoleren in meerdere maligniteiten8-11. We identificeerden met kankerstamcel verrijkte populaties in twee tumormodellen D5 en SCC7 door ALDEFLUOR als marker te gebruiken. We ontdekten ALDEFLUOR+ cellen in murien melanoom B16-D5 en plaveiselcelkanker SCC7. We ontdekten dat ALDEFLUOR+ cellen ongeveer 0,5% en 5,2% bijdragen in gekweekte D5- en SCC7-tumorcellijnen (figuur 1). Vers geoogste tumorcellen van gevestigde tumoren zijn geanalyseerd om het bestaan van ALDEFLUOR+ cellen te bevestigen. Zoals ook blijkt uit figuur 1,waren er respectievelijk 2,5% en 4,2% van de ALDEFLUOR+ cellen van in vivo gevestigde D5- en SCC7-tumoren. De tumorigeniciteit en het zelfvernieuwingsvermogen van deze gesorteerde D5- en SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH-hoge populaties werden geëvalueerd in de syngeneïsche immunocompetente gastheer, de C57BL/6- en C3H-muizen, respectievelijk8.
We hebben heterogene ongesorteerde tumorcellysaat gebruikt om DC's (H-TPDC) te pulseren, zowel in dierstudies als in klinische studies5,6. Om de immunogeniciteit van CSC's te onderzoeken, hebben we ALDHhoge CSC en gepulseerd DC geïsoleerd met het lysaat van de CSC's om CSC-TPDC te genereren (figuur 2) en H-TPDC gebruikt als een conventionele kankervaccincontrole om te testen of CSC-TPDC enig gunstig effect heeft bij het voorkomen van tumorgroei.
We evalueerden de immunogeniciteit van CSC's door beschermende antitumorimmuniteit geïnduceerd door CSC-TPDC te onderzoeken. In het D5-model werden naïeve immunocompetente muizen gevaccineerd s.c met CSC-TPDC of H-TPDC (bij hetzelfde lysaat: DC-verhouding). Controlegroepen kregen zoutoplossing (PBS). Een week na het laatste vaccin werden de muizen intraveneus uitgedaagd met ongesorteerde D5-tumorcellen(i.v.m.),en de longen werden 3 weken later geoogst om longmetastasen op te sommen. Zoals blijkt uit tabel 1, ontwikkelden muizen die met de H-TPDC werden behandeld, in vergelijking met de PBS-groep minder longmetastasen. Belangrijk is dat muizen die met CSC-TPDC werden behandeld significant minder longmetastasen hadden dan H-TPDC-vaccingroep in beide uitgevoerde experimenten. In het SCC7-model werden normale C3H-dieren gevaccineerd s.c met respectievelijk SCC7 CSC-TPDC of H-TPDC op de rechterflank, gevolgd door een uitdaging met ongesorteerde SCC7-tumorcellen s.c in de linkerflank. In vergelijking met de PBS-groep veroorzaakte H-TPDC een bescheiden antitumorimmuniteit tegen tumorgroei. Er was echter een significante remming van tumorgroei bij muizen die werden behandeld met CSC-TPDC in vergelijking met zowel de controlegroep als de H-TPDC-groep (p<0,05, figuur 3). Deze resultaten geven aan dat CSC's kunnen worden gebruikt als een effectievere antigeenbron om DC's te laden dan traditionele ongesorteerde tumorcellen bij het induceren van beschermende immuniteit tegen de uitdaging van tumorcellen.
Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de waargenomen CSC-geïnduceerde beschermende antitumorimmuniteit verder te begrijpen, hebben we de milt geoogst van de dieren die aan het einde van de experimenten aan DC-vaccinaties werden onderworpen. De miltcellen werden vervolgens geactiveerd door anti-CD3/CD28/IL-2 of anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. Vervolgens werden de kweeksupernatanten verzameld om de expressie van cytokinen en antilichamen te detecteren.  De miltcellen van de met D5 CSC-TPDC of SCC7 CSC-TPDC gevaccineerde dieren hadden significant hogere producties van IFNγ en GM-CSF (figuur 4). Bovendien was er significant (p<0,05) hogere IgG-productie door LPS/anti-CD40 geactiveerde miltcellen verzameld bij de dieren die waren gevaccineerd met D5 CSC-TPDC of SCC7 CSC-TPDC in vergelijking met D5 H-TPDC of SCC7 H-TPDC. Deze antilichamen bleken zich te binden aan respectievelijk D5 - en SCC7-CSC 's , en een dergelijke binding zou kunnen leiden tot de CSC-lysis in aanwezigheid van complement8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Figuur 1. ALDHFLUOR+/ALDHhoge populaties werden gedetecteerd in gekweekte evenals nieuw geoogste verse murine D5 melanoom en SCC7 plaveiselceltumoren. Tumorcellen behandeld met 50 mmol/L DEAB, een specifieke ALDH-remmer, werden gebruikt als negatieve controle.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Figuur 2. Generatie van dendritische celgebaseerde kankerstamcelvaccins. Voor de bereiding van CSC-TPDC en H-TPDC werden beenmerg-afgeleide dendritische cellen gepulseerd met respectievelijk ALDHhoge of ongesorteerde tumorcellysaten.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Figuur 3. CSC lysaat gepulseerd DC (CSC-TPDC) vaccin kan een effectievere beschermende antitumor immuniteit induceren in de s.c. SCC7 tumor model. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Figuur 4. Krachtigere systemische cellulaire reacties in immunocompetente gastheer gevaccineerd met CSC-TPDC.  Splenocyten werden geoogst van de dieren die werden onderworpen aan H-TPDC- of CSC-TPDC-vaccinatie en werden geactiveerd zoals aangegeven. De kweeksupernatanten werden vervolgens verzameld voor cytokinedetectie met behulp van ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells at JoVE.com

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Geëvalueerd in syngeneïsche immunocompetente gastheren, toonde het op kankerstamcel (CSC) gebaseerde dendritische cel (DC) vaccin een significant hogere antitumorimmuniteit aan dan traditionele DC-vaccins gepulseerd met heterogene bulktumorcellen.

Generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kwantitatieve beoordeling van immuuncellen in de gekwetste ruggenmergweefsel door flowcytometrie: een roman te gebruiken voor een cel zuiveringsmethode

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Geautomatiseerde Cel Verrijking van Cytomegalovirus-specifieke T-cellen voor klinische toepassingen met het cytokine-beeldverwerkingssysteem

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...