Name: generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00
Duration: 12 min 43 s
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Diese Arbeit wurde vom Will and Jeanne Caldwell Endowed Research Fund des University of Michigan Comprehensive Cancer Center und teilweise von NIH Grant CA82529 und der Gillson Longenbaugh Foundation unterstützt.

1. ALDEFLUOR Färbung
<ol><li>Zellprobenpräparation: Bereiten Sie die einzelzellige Suspension von Tumorzellen vor, entweder aus kultivierten Tumorzellen oder aus frisch geernteten Tumorproben. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml im ALDEFLUOR Assay Buffer an.</li>
	<li>Etikettieren Sie vier 12 mm x 75 mm Polystyrol-Reagenzgläser als Steuerröhrchen wie folgt: #1: Unstained, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR plus DEAB und #4: 7AAD.</li>
	<li>Für diese Steuerröhrchen 1ml Zellsuspension in #1 und #4, aber 2 ml in Tube #2. Fügen Sie 5 l DEAB (ALDH-Hemmer) in die #3 und auf Eis zu halten. Dann 10 l aktiviertes ALDEFLUOR-Substrat in die #2 der Röhre geben, mischen und sofort 1 ml des Gemischs auf #3 übertragen.</li>
	<li>Zur gleichen Zeit fügen Sie den übrigen Zellen (Probenröhren) auch bei 1 x 106 Zellen/ml im ALDEFLUOR Assay Buffer ein aktiviertes ALDEFLUOR-Substrat pro Million Zellen hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie sowohl die 4 Steuerröhrchen als auch die Probenröhrchen 30 min im 37 °C Wasserbad.</li>
	<li>Nach der Inkubation fügen Sie dem Probenröhrchen 5 l 7AAD #4 und 1 l 7AAD 1 x 106 Zellen in das Probenröhrchen. 10 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie alle Rohre für 5 min bei 250 x g und entfernen Sie Überstand.</li>
	<li>Resuspend-Zellen im ALDEFLUOR-Assaypuffer.</li>
	<li>Führen Sie eine Flusszytometrie-basierte Sortierung durch.</li>
	<li>Stellen Sie die Sortiertore mit ALDEFLUOR-gefärbten Zellen, die mit DEAB behandelt werden, als Negativkontrolle und der Propidiumjodid (PI) 7AAD- gebeizten Zellen zur Lebensfähigkeitskontrolle. Basierend auf diesen Steuerungen wurde ein Gate eingerichtet, umdie ALDEFLUOR+/ALDH-Hoch-, D5- und SCC7-Zellen zu unterscheiden. Diese Tore werden dann verwendet, um alle oben für die ALDEFLUOR+/ALDH-Hoch-D5- und SCC7-Zellen vorbereiteten Probenzellen zu sortieren.</li>
</ol>2. Präparation von KrebsStammzell-Lysat-Puls Dendritic Cell (CSC-TPDC) Impfstoff
<ol><li>Euthanisieren Sie Mäuse (syngene B6 bzw. C3H) mitCO2 und isolieren Sie Oberschenkelknochen und Tibiaknochen.</li>
	<li>Legen Sie die Knochen in 75% Ethanol für 1 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Knochen mit HBSS.</li>
	<li>Kopf abschneiden und mit einer 21 G Nadel und einer 10 ml Spritze Zellen in eine Schale schieben.</li>
	<li>Die Zellen mit der Spritze ansaugen und blasen, um die einzellige Suspension herzustellen.</li>
	<li>Nach zentrifugieren in 1.500 U/min für 5 min, entsorgen Sie den Überstand. Dann 5 ml RBC Lysepuffer hinzufügen, um den RBC für 1 min im 37 °C Wasserbad zu lysieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellzahl und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 Million Zellen/ml in einem vollständigen Medium (CM) an, das 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 enthält.</li>
	<li>Kultur die Zellen und kompensieren CM plus IL-4 und GM-CSF 3 Tage später.</li>
	<li>Am5. Tag die unreifen dendritischen Zellen (DCs) ernten und das DC-Isolationsmedium mit 4,2 ml Lösung C plus 1 ml OptiPrep Dichtegradientenmedium vorbereiten.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellpellets in 5 ml CM auf. Fügen Sie die Zellsuspension langsam auf das Isolationsmedium ein. Zentrifuge bei 2.000 U/min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Sammeln Sie die DCs zwischen cmCM und Isolationsmedium. Zählen Sie die Zellzahl und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 Million Zellen/ml im Kulturmedium an, das 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 enthält.</li>
	<li>Bereiten Sie Tumorlysate vor, indem SieALDH-hoch- oder unsortierte D5- oder SCC7-Zellen im Kulturmedium aussetzen und viermal schnellen Frost-Tau-Expositionen ausgesetzt werden, gefolgt von Spin bei 100 x g für 5 min, um den Membrananteil der Lysate zu sammeln.</li>
	<li>Zur Herstellung von CSC-TPDC, Puls DCs mit dem Lysat von autologen ALDHhohe Zellen. Zur Vorbereitung von H-TPDC werden Puls-DCs mit unsortiertem heterogenen Tumorzelllysat. Das Verhältnis von Gleichstrom zu Tumorzelllysat ist das gleiche.</li>
</ol>3. Impfung und Bewertung der Wirksamkeit
<ol><li>Impfen Normal-B6-Mäuse jeweils mit 2.500 D5 CSC-TPDC oder D5 H-TPDC Tumorzellen subkutan (s.c.). Impfen Normal C3H Tiere .c. mit 5.000 SCC7 CSC-TPDC oder SCC7 H-TPDC Tumorzellen, bzw.</li>
	<li>Fordern Sie nach der Impfung die B6-Mäuse mit den heterogenen D5-Tumorzellen an, d.h. Euthanisieren Sie die Mäuse 2 20 Tage später mitCO. Die Lunge ernten und Lungenmetastasen aufzählen.</li>
	<li>Im SCC7-Modell fordern Sie die C3H-Mäuse mit unsortierten SCC7-Tumorzellen s.c auf der gegenüberliegenden Seite des DC-Impfstoffs heraus. Überwachen Sie die Tumorgröße.</li>
	<li>Am Ende der Experimente euthanisieren die B6- und C3H-Mäuse mit CO2. An Tag 34 nach dem ersten Impfstoff, einschläfern Mäuse mitCO2, und zur gleichen Zeit sammeln die Milz jeder Gruppe mit einem aseptischen Verfahren.</li>
	<li>Aktivieren Sie Milz-T- und/oder B-Zellen mit immobilisierten Anti-CD3 plus Anti-CD28 mAbs in CM, die hrIL-2 oder LPS plus Anti-CD40 (FGK45) mAb-Aszites enthalten.</li>
	<li>Sammeln Sie nach der Aktivierung Überstand und verwenden Sie den ELISA-Test.</li>
	<li>Für ELISA-Assay, Beschichtungsplatten mit Antikörpern für IFN, GM-CSF und IgG bei 4 °C O/N.</li>
	<li>Nach dem Auftragen des Sperrpuffers Proben und Standards hinzufügen und bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte und fügen Sie HRP-Erkennungsantikörper und TMB-Substrat für die Inkubation hinzu.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption eines ELISA-Plattenlesers bei 450 nm innerhalb von 30 min nach Beendigung der Reaktion.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

STEMCELL Technologies hat Open Access-Publikationsgebühren unterstützt.

Die immungeschwächten Wirte, wie Z. CCID-Mäuse, schließen immunologische Beurteilungen von CSCs aus, da es an adaptiver Immunität innerhalb der Hosts fehlt. In dieser Studie haben wir die Immunogenität von CSCs bei immunkompetenten Wirten untersucht, die Patienteneinstellungen genauer nachahmen könnten. Angereicherte CSCs sind immunogen und könnten eine wirksamere Tumorschutzimmunität hervorrufen, wenn ihre Lysate als Impfstoff auf DCs geladen werden, verglichen mit nicht ausgewählten Tumorzelllysat-pulsierten DCs.  Mechanistisch wurde der Schutz durch selektive Induktion von CSC-reaktiven Antikörpern und T-Zellen8 sowie durch die Herstellung von Typ-1-Zytokin, z. B. IFN und GM-CSF, gewährt.
Die meisten der aktuellen Immuntherapien, einschließlich dendritischer zellbasierter Impfstoffe und der Adoptiv-T-Zelltransfer, sind auf tumordifferenzierte Antigene ausgerichtet. CSCs, die diese differenzierten Antigene möglicherweise nicht ausdrücken, können daher diesen immunologischen Targetings entgehen. Im Gegensatz dazu kann ein CSC-Impfstoff, der speziell auf Krebsstammzellen abzielt, diese spezielle Population der Krebszellen zerstören und so die therapeutische Wirksamkeit des Impfstoffs verbessern, indem er Tumorrückfälle und Metastasen verhindert.
Sowohl in kultivierten Tumorzellen als auch in frisch geernteten Tumoren identifizierten wir die CSC-angereicherte Population durch Durchflusszytometrie auf Basis einer hohen Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität. SolcheALDH-Hochzellen könnten durch Durchflusssortierung isoliert werden, um als Antigenquelle verwendet zu werden, um DC zu pulsieren, um CSC-TPDCs zu erzeugen. VergleichmitALDH-Hochzellen, die aus kultivierten Tumorzellen im Vergleich zu frisch geernteten Tumoren isoliert wurden, zeigte kein signifikanter Unterschied in der Termität der Induktion der Anti-CSC-Immunität8. Diese Ergebnisse zeigten das Potenzial, CSCs zu verwenden, die entweder aus kultivierten Tumorzellen oder aus frisch geernteten Tumoren für die klinische Anwendung isoliert sind.
Um klinisch relevant zu sein, muss ein Impfstoff in einem therapeutischen Umfeld untersucht werden. Diese Experimente werden nun in unserem Labor durchgeführt.

Krebsstammzellen sind relativ resistent gegen konventionelle Chemo- und Strahlentherapie1,2. Auf der anderen Seite könnte diese Population von Zellen die Zellen sein, die für den Rückfall und das Fortschreiten von Krebs nach traditionellen Krebstherapien verantwortlich sind1-4. Aufgrund der fehlenden Expression differenzierter Tumorantigene auf Krebsstammzellen können Krebsstammzellen aktuellen immunologischen Therapien bei Krebs entfliehen, die meist darauf ausgelegt sind, die Antigene auf die differenzierten Tumorzellen zu zielen. Daher kann die Entwicklung neuer Strategien, die speziell auf die Krebsstammzellen abzielen und diese zerstören, Versprechen halten, die therapeutische Wirksamkeit der aktuellen Krebsbehandlung zu erhöhen. Zu diesem Zweck isolierten wir Krebsstammzellen (CSC) angereicherte Populationen aus zwei Tiertumoren (Melanom D5 und Plattenepithelkarzinom SCC7) und verwendeten sie als Antigenquelle, um Antigen-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, DC) zur Vorbereitung des CSC-TPDC-Impfstoffs zu pulsieren. Anschließend werteten wir die durch den CSC-TPDC-Impfstoff induzierte Antitumorimmunität bei den syngenischen immunkompetenten Wirten, B6-Mäusen bzw. C3H-Mäusen. Die CSC-TPDC-induzierte Antitumor-Wirksamkeit wurde mit dem traditionellen DC-Impfstoff verglichen, der mit Lysat aus unsortierten heterogenen Tumorzellen (H-TPDC) gepulst wurde, der zuvor von unserer Gruppe5,6sowie von anderen Forschern7 sowohl in präklinischen Studien als auch in klinischen Studien verwendet wurde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

Wir identifizierten Krebsstammzell(CSC)-angereicherte Populationen von murinen Melanom D5 syngenen bis C57BL/6 Mäuse n. Chr. und dem Plattenepithelkarzinom SCC7 syngeneic zu C3H-Mäusen mit ALDEFLUOR/ALDH als Marker, und testeten ihre Immunogenität mit dem Zelllysat als Quelle von Antigenen, um dendritische Zellen (DCs) pulsieren zu lassen. DCs, die mitALDH-hohen CSC-Lysaten gepulst wurden, induzierten eine signifikant höhere schützende Antitumorimmunität als DCs, die mit den Lysaten unsortierter ganzer Tumorzelllysate in beiden Modellen und in einer Lungenmetastasierung und einer s.c gepulst wurden. Tumorwachstumseinstellung. Dieses Phänomen war auf CSC-Impfstoff-induzierte humorale sowie zelluläre Anti-CSC-Antworten zurückzuführen. Insbesondere Splenozyten, die vom Host isoliert wurden, der DemCSC-DC-Impfstoff ausgesetzt war, produzierten eine signifikant höhere Menge an IFN und GM-CSF als Splenozyten, die vom Wirt isoliert wurden, der einem unsortierten Tumorzelllysat-Geflossen-DC-Impfstoff unterzogen wurde. Diese Ergebnisse unterstützen die Bemühungen, einen autologen Therapeutischen Impfstoff auf CSC-Basis für den klinischen Einsatz in einem adjuvanten Umfeld zu entwickeln.

ALDEFLUOR/ALDH wurde als Einzelmarker verwendet, um Stammzellen in mehreren Malignitäten8-11zu isolieren. Wir identifizierten Krebsstammzell-angereicherte Populationen in zwei Tumormodellen D5 und SCC7, indem wir ALDEFLUOR als Marker verwendet. Wir haben ALDEFLUOR+ Zellen bei dem murinen Melanom B16-D5 und Demkmittelzellkrebs SCC7 nachgewiesen. Wir fanden heraus, dass ALDEFLUOR+-Zellen etwa 0,5 % bzw. 5,2 % zu kultivierten D5- bzw. SCC7-Tumorzelllinien beitragen (Abbildung 1). Frisch geerntete Tumorzellen aus etablierten Tumoren wurden analysiert, um die Existenz von ALDEFLUOR+-Zellen zu bestätigen. Wie auch in Abbildung 1dargestellt, gab es 2,5% bzw. 4,2% der ALDEFLUOR+-Zellen aus in vivo etablierten D5- und SCC7-Tumoren. Die Tumorigenität und die Selbsterneuerungskapazität dieser sortierten D5- und SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH-Hochpopulationen wurden beim syngenischen immunkompetenten Wirt, den C57BL/6 und C3H-Mäusen bzw.8,untersucht.
Wir haben heterogenes unsortiertes Tumorzelllysat zu Puls-DCs (H-TPDC) sowohl in Tierstudien als auch in klinischen Studien5,6verwendet. Um die Immunogenität von CSCs zu untersuchen, isolierten wirALDH-hoch CSC und gepulste Gleichstrom mit dem Lysat der CSCs zu generiertem CSC-TPDC (Abbildung 2) und verwendeten H-TPDC als konventionelle Krebsimpfstoffkontrolle, um zu testen, ob CSC-TPDC eine positive Wirkung bei der Verhinderung von Tumorwachstum hat.
Wir haben die Immunogenität von CSCs untersucht, indem wir die durch CSC-TPDC induzierte schutzbeschützende Antitumorimmunität untersucht haben. Im D5-Modell wurden naive immunkompetente Mäuse s.c mit CSC-TPDC oder H-TPDC geimpft (bei gleichem Lysat: DC-Verhältnis). Kontrollgruppen erhielten Saline (PBS). Eine Woche nach dem letzten Impfstoff wurden die Mäuse mit unsortierten D5-Tumorzellen intravenös herausgefordert (i.v.), und die Lunge wurde 3 Wochen später geerntet, um Lungenmetastasen aufzuzählen. Wie in Tabelle 1dargestellt, entwickelten Mäuse, die mit dem H-TPDC behandelt wurden, im Vergleich zur PBS-Gruppe weniger Lungenmetastasen. Wichtig ist, dass Mäuse, die mit CSC-TPDC behandelt wurden, in beiden durchgeführten Experimenten deutlich weniger Lungenmetastasen hatten als die H-TPDC-Impfstoffgruppe. Im SCC7-Modell wurden normale C3H-Tiere s.c mit SCC7 CSC-TPDC bzw. H-TPDC auf der rechten Flanke geimpft, gefolgt von einer Herausforderung mit unsortierten SCC7-Tumorzellen s.c in die linke Flanke. Im Vergleich zur PBS-Gruppe induzierte H-TPDC eine bescheidene Anti-Tumor-Immunität gegen Tumorwachstum. Allerdings gab es eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums bei Mäusen, die mit CSC-TPDC behandelt wurden, verglichen mit der Kontrollgruppe und der H-TPDC-Gruppe (p<0.05, Abbildung 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CSCs als effektivere Antigenquelle verwendet werden könnten, um DCs zu laden als herkömmliche unsortierte Tumorzellen bei der Induktion einer schützenden Immunität gegen die Herausforderung von Tumorzellen.
Um die Mechanismen, die der beobachteten CSC-induzierten Schutzantitumor-Immunität zugrunde liegen, weiter zu verstehen, haben wir die Milz von den Tieren geerntet, die am Ende der Experimente DC-Impfungen unterzogen wurden. Die Milzzellen wurden dann durch Anti-CD3/CD28/IL-2 oder Anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40 aktiviert. Dann wurden die Kulturüberstände gesammelt, um den Ausdruck von Zytokinen und Antikörpern zu erkennen.  Deutlich höhere Produktionen von IFN und GM-CSF durch die Milzzellen der mit D5 CSC-TPDC oder SCC7 CSC-TPDC geimpften Tiere (Abbildung 4) gab es. Darüber hinaus gab es eine signifikant (p<0,05) höhere IgG-Produktion durch LPS/Anti-CD40 aktivierte Milzzellen, die von den mit D5 CSC-TPDC oder SCC7 CSC-TPDC geimpften Tieren gesammelt wurden, verglichen mit D5 H-TPDC oder SCC7 H-TPDC. Es wurde festgestellt, dass diese Antikörper an D5 bzw. SCC7 CSCs binden, und eine solche Bindung könnte in Gegenwart von Komplement8zur CSC-Lyse führen.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Abbildung 1. ALDHFLUOR+/ALDHhohe Populationen wurden sowohl bei kultivierten als auch bei neu geernteten frisch geernteten murinen D5-Melanomen und SCC7-Plattenepitheltumoren nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurden Tumorzellen verwendet, die mit 50 mmol/L DEAB, einem spezifischen ALDH-Hemmer, behandelt wurden.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Abbildung 2. Generierung von dendritischen zellbasierten Krebsstammzellen-Impfstoffen. Zur Herstellung von CSC-TPDC und H-TPDC wurden von Knochenmark abgeleitete dendritische Zellen mitALDH-hoch- bzw. unsortierten Tumorzelllysaten gepulst.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Abbildung 3. CSC-Lysat-gepulster DC-Impfstoff (CSC-TPDC) könnte eine wirksamere Schutz-Antitumor-Immunität in der s.c induzieren. SCC7 Tumormodell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Abbildung 4. Stärkere systemische zelluläre Reaktionen bei immunkompetenten Wirten, die mit CSC-TPDC geimpftwurden.  Splenozyten wurden von den Tieren geerntet, die der H-TPDC- oder CSC-TPDC-Impfung unterzogen wurden, und wurden wie angegeben aktiviert. Die Kulturüberstandmittel wurden dann zur Zytokin-Erkennung mit ELISA gesammelt.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

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Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Bewertet in syngeneimmunen immunkompetenten Wirten zeigte der Krebsstammzell-Impfstoff (CSC) eine signifikant höhere Antitumorimmunität als herkömmliche DC-Impfstoffe, die mit heterogenen Massentumorzellen gepulst wurden.

Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...