Name: generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של וויל וז'אן קולדוול של המרכז המקיף לסרטן באוניברסיטת מישיגן ובחלקה על ידי NIH grant CA82529 וקרן גילסון לונגנבו.

1. כתמי אלדפלור
<ol><li>הכנת דגימת תא: הכינו השעיית תא יחיד של תאים סרטניים, או מתאי גידול מתורבתים או מדגימות גידול שנקטפו זה עתה. לספור את התאים ולהתאים את השעיית התא לריכוז של 1 x 106 תאים / מיליליטר במאגר ALDEFLUOR Assay.</li>
	<li>תווית ארבע 12 מ"מ x 75 מ"מ מבחנות פוליסטירן כמו צינורות בקרה כדלקמן: #1: מוכתם, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR בתוספת DEAB, ו #4: 7AAD.</li>
	<li>עבור צינורות בקרה אלה, מניחים השעיית תא 1 מ"ל לתוך #1 #4, אבל 2 מיליליטר לתוך צינור #2. מוסיפים 5 μl DEAB (מעכב ALDH) #3 הצינור ולשמור על קרח. לאחר מכן להוסיף 10 μl מופעל מצע ALDEFLUOR כדי צינור #2, לערבב ולהעביר מיד 1 מ"ל של התערובת כדי צינור #3.</li>
	<li>במקביל, להוסיף 2 μl מופעל ALDEFLUOR מצע לכל מיליון תאים לשאר התאים (מדגם צינורות) גם ב 1 x 106 תאים / מיליליטר ב ALDEFLUOR Assay Buffer.</li>
	<li>דגירה הן את 4 צינורות הבקרה ואת צינורות מדגם במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס אמבט מים.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להוסיף 5 μl 7AAD לתוך צינור הבקרה #4, ו 1 μl 7AAD 1 x 106 תאים לצינור המדגם. דגירה 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>צנטריפוגה כל הצינורות במשך 5 דקות ב 250 x g ולהסיר supernatant.</li>
	<li>התחדשו בתאים במאגר השיאול ALDEFLUOR.</li>
	<li>בצע מיון מבוסס ציטומטריית זרימה.</li>
	<li>הגדר את שערי המיון באמצעות תאים מוכתמים ב- ALDEFLUOR שטופלו ב- DEAB כפקד שלילי ואת תאי הפרובידיום יודיד (PI) 7AAD מוכתמים לבקרת כדאיות. בהתבסס על פקדים אלה, נקבע שער כדי להבחין בין התאים ALDEFLUOR+/ALDHגבוה,D5 ו SCC7. שערים אלה ישמשו לאחר מכן כדי למיין את כל התאים לדוגמה שהוכנו לעיל עבור ALDEFLUOR +/ALDHגבוה D5 ו SCC7 תאים.</li>
</ol>2. הכנת תא גזע סרטני Lysate-דופק דנדריטי תא (CSC-TPDC) חיסון
<ol><li>המתת חסד עכברים (B6 סינגני ו- C3H, בהתאמה) באמצעות CO 2 ולבודד אתעצם הירך ועצמות השוקה.</li>
	<li>שים את העצמות 75% אתנול במשך 1 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את העצמות באמצעות HBSS.</li>
	<li>חותכים את הראש את העצמות ולהשתמש מחט 21 G ו 10 מ"ל מזרק לדחוף תאים לתוך צלחת.</li>
	<li>לשאוף ולפוצץ את התאים באמצעות המזרק כדי להפוך את ההשעיה תא יחיד.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה ב 1,500 סל"ד במשך 5 דקות, להשליך את supernatant. לאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר RBC מאגר תמוגה כדי lysis RBC במשך 1 דקות ב 37 מעלות צלזיוס אמבט מים.</li>
	<li>ספור את מספר התא והתאם את השעיית התא לריכוז של מיליון תאים/מ"ל באמצעי מלא (CM) המכיל 10 ננוגרם/מיליליטר GM-CSF ו- 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>תרבית את התאים ולפצות CM בתוספת IL-4 ו GM-CSF 3 ימים לאחר מכן.</li>
	<li>ביוםהחמישי, לקצור את התאים התותבת בשלים (DC) ולהכין את מדיום בידוד DC המכיל 4.2 מיליליטר פתרון C בתוספת 1 מיליליטר אופטיפריפ צפיפות הדרגתי בינוני.</li>
	<li>להשעות את כדורי התא ב 5 מיליליטר CM. הוסף את המתלה התא על מדיום הבידוד לאט. צנטריפוגה ב-2,000 סל"ד בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>אסוף את בקרי ה- DC בין CM לבין אמצעי הבידוד. לספור את מספר התא ולהתאים את השעיית התא לריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר במדיום תרבות המכיל 10 ng / ml GM-CSF ו 10 ng / ml IL-4.</li>
	<li>הכן lysates הגידול על ידי השעיית ALDHגבוה או לא ממוין D5 או SCC7 תאים בינוני תרבות כפוף חשיפות ההפשרה הקפאה מהירה ארבע פעמים ואחריו ספין ב ∼100 x g במשך 5 דקות כדי לאסוף את החלק הממברנה של lysates.</li>
	<li>כדי להכין CSC-TPDC, בקרי בקרה (DC) דופק עם lysate של תאיםגבוהים ALDH אוטולוגי. כדי להכין H-TPDC, DC דופק עם ליסקים תאים סרטניים הטרוגניים לא ממוינים. היחס בין DC לתאי הגידול lysate זהה.</li>
</ol>3. חיסון והערכת היעילות
<ol><li>לחסן עכברי B6 נורמלי בהתאמה עם 2,500 D5 CSC-TPDC או D5 H-TPDC תאים סרטניים תת עורית (s.c.). לחסן בעלי חיים רגילים C3H s.c. עם 5,000 SCC7 CSC-TPDC או SCC7 H-TPDC תאים סרטניים, בהתאמה.</li>
	<li>לאחר החיסון, אתגר את העכברים B6 עם תאים סרטניים D5 הטרוגניים i.v. המתת עכברים באמצעות CO2 20 ימים מאוחר יותר. לקצור את הריאות ולתאר גרורות ריאות.</li>
	<li>במודל SCC7, לאתגר את העכברים C3H עם תאי גידול SCC7 לא ממוינים s.c בצד השני של החיסון DC. לפקח על גודל הגידול.</li>
	<li>בסוף הניסויים המתת חסד עכברי B6 ו- C3H באמצעות CO2. ביום 34 לאחר החיסון הראשון, המתת חסד עכברים עם CO2, ובמקביל לאסוף את הטחולים של כל קבוצה עם הליך אספטי.</li>
	<li>הפעל תאי טחול T ו/או B עם אנטי-CD3 משותק בתוספת אנטי-CD28 mAbs ב- CM המכילים hrIL-2 או LPS בתוספת מיימת אנטי-CD40 (FGK45) mAb.</li>
	<li>לאחר ההפעלה, לאסוף supernatants ולהשתמש עבור ELISA assay.</li>
	<li>לבדיקת ELISA, צלחות מעיל עם נוגדנים ל-IFNγ, GM-CSF ו-IgG ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר היישום של מאגר חסימה, להוסיף דגימות ותקנים דגירה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת ולהוסיף נוגדן זיהוי HRP ומצע TMB עבור דגירה.</li>
	<li>למדוד את הספיגה על קורא צלחת ELISA ב 450 ננומטר בתוך 30 דקות לאחר עצירת התגובה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

STEMCELL טכנולוגיות תמכה בדמי פרסום של Open Access.

המארחים immunocompromised, כגון עכברי SCID, למנוע הערכות אימונולוגיות של CSCs בשל היעדר חסינות הסתגלות בתוך המארחים. במחקר זה, הערכנו את האימונוגניות של CSCs במארחים חיסוניים, אשר יכול לחקות באופן הדוק יותר את הגדרות המטופל. CSCs מועשרים הם אימונוגניים ויכולים לגרום לחסינות יעילה יותר להגנה מפני גידולים כאשר הליסטים שלהם נטענים ל- DCs כחיסון בהשוואה למחשבי DCs עם פעימות ליאסט של תאים סרטניים שלא נבחרו.  מבחינה מכנית, ההגנה הוענקה על ידי אינדוקציה סלקטיבית של נוגדנים תגובתי CSC ותאי T8, כמו גם ייצור של ציטוקינים מסוג 1, למשל IFNγ ו- GM-CSF.
רוב האימונותרפיות הנוכחיות, כולל חיסונים מבוססי תאים דנדריטיים והעברת תאי T מאמצים, נועדו למקד אנטיגנים מובחנים בגידולים. CSCs, אשר לא יכול לבטא אנטיגנים אלה מובחנים ולכן עשוי לברוח אלה מיקוד אימונולוגי. לעומת זאת, חיסון CSC שנועד במיוחד למקד תאי גזע סרטניים עלול להרוס אוכלוסייה מיוחדת זו של התאים הסרטניים, ובכך לשפר את היעילות הטיפולית של החיסון על ידי מניעת הישנות הגידול גרורות.
הן בתאי הגידול התרבותיים והן בגידולים שנקטפו זה עתה, זיהינו אוכלוסייה מועשרת ב- CSC על ידי ציטומטריית זרימה המבוססת על פעילות אלדהיד דהידרוגנאז גבוהה. תאיםגבוהים אלה ALDH יכול להיות מבודד על ידי מיון זרימה כדי לשמש כמקור אנטיגן דופק DC כדי ליצור CSC-TPDCs. השוואה באמצעות תאיםגבוהים ALDH מבודדים מתאי גידול מתורבת לעומת גידולים שנקטפו טריים לא הפגינו הבדל משמעותי בטווח של אינדוקציה של חסינות נגד CSC8. תוצאות אלו חשפו את הפוטנציאל להשתמש CSCs מבודדים או מתאי גידול מתורבתים או גידולים שנקטפו טריים ליישום קליני.
כדי להיות רלוונטי מבחינה קלינית, חיסון צריך להיבדק בסביבה טיפולית. ניסויים אלה מבוצעים כעת במעבדה שלנו.

תאי גזע סרטניים עמידים יחסית לכימותרפיה והקרנות קונבנציונליות1,2. מצד שני, אוכלוסייה זו של תאים עשויה להיות התאים האחראים על הישנות והתקדמות של סרטן לאחר טיפולים מסורתיים בסרטן1-4. בשל חוסר ביטוי של אנטיגנים סרטניים מובחנים על תאי גזע סרטניים, תאי גזע סרטניים עשויים לברוח התערבויות אימונולוגיות הנוכחי של טיפול בסרטן, אשר נועדו בעיקר למקד את האנטיגנים על תאים סרטניים מובחנים. לכן, פיתוח אסטרטגיות חדשות במיוחד מיקוד והרס תאי גזע סרטניים עשוי להחזיק הבטחות להגדיל את היעילות הטיפולית של הטיפול בסרטן הנוכחי. למטרה זו, בודדנו אוכלוסיות מועשרות בתאי גזע סרטניים (CSC) משני גידולים מן החי (מלנומה D5 וסרטן תאי קשקש SCC7), והשתמשנו בהם כמקור אנטיגן לדופק תאים מציגים אנטיגן (תאים דנדריטיים, DC) כדי להכין את החיסון CSC-TPDC. לאחר מכן הערכנו את חסינות האנטיטומור הנגרמת על ידי חיסון CSC-TPDC במארחים האימונו-כשירים הסיגניים, עכברי B6 ועכברי C3H בהתאמה. היעילות CSC-TPDC-induced antitumor הושווה עם החיסון DC המסורתי פעמו עם lysate מתאי גידול הטרוגניים לא ממוינים (H-TPDC), אשר שימש בעבר על ידי הקבוצה שלנו5,6, כמו גם על ידי חוקרים אחרים7 הן במחקרים פרה קליניים והן בניסויים קליניים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

זיהינו תא גזע סרטני (CSC)-מועשר אוכלוסיות מן מורין מלנומה D5 סינגנית C57BL/6 עכברים ואת סרטן קשקש SCC7 סינג'יני לעכברים C3H באמצעות ALDEFLUOR / ALDH כסמן, ובדק את האימונוגניות שלהם באמצעות ליזל התא כמקור של אנטיגנים דופק תאים דנדריטיים (DCs). DCs פעמו עם ALDHגבוה CSC lysates המושרה חסינות antitumor מגן גבוה משמעותית מאשר DCs פעמו עם lysates של ליסטים תאים סרטניים שלמים לא ממוינים בשני הדגמים בהגדרת גרורות ריאות ו s.c. הגדרת צמיחת הגידול, בהתאמה. תופעה זו נבעה מתגובות הומוריסטיות ומושרות על ידי CSC וכן תגובות אנטי-CSC תאיות. בפרט, טחול מבודד מהמארח נתון חיסון CSC-DC המיוצר כמות גבוהה משמעותית של IFNγ ו- GM-CSF מאשר טחול מבודד מהמארח נתון חיסון תאי גידול לא ממוין lysate פעמו-DC. תוצאות אלו תומכות במאמצים לפתח חיסון טיפולי מבוסס CSC אוטולוגי לשימוש קליני בסביבה אדג'ובנטית.

ALDEFLUOR / ALDH שימש כסמן יחיד כדי לבודד תאי גזע ממאירויות מרובות8-11. זיהינו אוכלוסיות מועשרות בתאי גזע סרטניים בשני דגמי גידולים D5 ו- SCC7 באמצעות ALDEFLUOR כסמן. זיהינו ALDEFLUOR+ תאים מורין מלנומה B16-D5 וסרטן תאים קשקש SCC7. מצאנו שתאי ALDEFLUOR+ תורמים כ-0.5% ו-5.2% בקווי התאים הגידולים D5 ו-SCC7, בהתאמה (איור 1). תאים סרטניים שנקטפו זה עתה מגידולים מבוססים נותחו כדי לאשר את קיומם של תאי ALDEFLUOR+ . כפי שמוצג גם באיור 1, היו 2.5% ו-4.2% מתאי ALDEFLUOR+ מגידולים מבוססים של Vivo D5 ו-SCC7, בהתאמה. הגידוליות ויכולת ההתחדשות העצמית של אוכלוסיותגבוהות אלה D5 ו- SCC7 ALDEFLUOR +/ALDH הוערכו במארח האימונו-כשיר הסיגני, בעכברי C57BL/6 ו- C3H, בהתאמה8.
השתמשנו lysate תא גידול לא ממוין הטרוגניים כדי דופק DC (H-TPDC) הן במחקרים שנעשו בבעלי חיים והן בניסויים קליניים5,6. כדי לבחון את האימונוגניות של CSCs, בודדנו את ה- CSCהגבוה של ALDH ופעמנו DC עם ליסק"ק שנוצר CSC-TPDC (איור 2) והשתמשנו ב- H-TPDC כבקרת חיסון קונבנציונלית לסרטן כדי לבדוק אם ל- CSC-TPDC יש השפעה מועילה במניעת צמיחת הגידול.
הערכנו את האימונוגניות של CSCs על ידי בחינת חסינות antitumor מגן המושרה על ידי CSC-TPDC. במודל D5, עכברים חיסוניים נאיביים חוסנו s.c עם CSC-TPDC או H-TPDC (באותו ליזאט: יחס DC). קבוצות בקרה קיבלו מלוחים (PBS). שבוע לאחר החיסון האחרון, העכברים אותגרו עם תאי גידול D5 לא ממוינים דרך הווריד (כלומר),והריאות נקצרו 3 שבועות לאחר מכן כדי למנות גרורות ריאות. כפי שמוצג בטבלה 1, בהשוואה לקבוצת PBS, עכברים שטופלו ב- H-TPDC פיתחו פחות גרורות ריאות. חשוב לציין, עכברים שטופלו CSC-TPDC היו באופן משמעותי פחות גרורות ריאות מאשר קבוצת חיסון H-TPDC בשני הניסויים שבוצעו. במודל SCC7, בעלי חיים רגילים C3H חוסנו s.c עם SCC7 CSC-TPDC או H-TPDC בהתאמה על האגף הימני, ואחריו מאתגר עם תאים סרטניים SCC7 לא ממוינים.c לאגף השמאלי. בהשוואה לקבוצת PBS, H-TPDC המושרה חסינות אנטי גידול צנוע נגד גידולים. עם זאת, היה עיכוב משמעותי של צמיחת הגידול בעכברים שטופלו ב- CSC-TPDC בהשוואה הן לקבוצת הביקורת והן לקבוצת H-TPDC (p<0.05, איור 3). תוצאות אלה מצביעות על כך CSCs יכול לשמש כמקור אנטיגן יעיל יותר לטעון DCs מאשר תאים סרטניים לא ממוינים מסורתיים בגרימת חסינות מגן מפני האתגר של תאים סרטניים.
כדי להבין עוד יותר את המנגנונים שבבסיס חסינות האנטי-טוטומור המגן הנצפה של CSC, קצרנו את הטחולים מבעלי החיים שנחשפו לחיסונים בוושינגטון בסוף הניסויים. תאי הטחול הופעלו לאחר מכן על-ידי אנטי-CD3/CD28/IL-2 או אנטי-CD3/CD28/IL-2 + LPS/אנטי-CD40. לאחר מכן נאספו supernatants התרבות כדי לזהות את הביטוי של ציטוקינים ונוגדנים.  היו הפקות גבוהות משמעותית של IFNγ ו- GM-CSF על ידי תאי הטחול מבעלי החיים שחוסנו עם D5 CSC-TPDC או SCC7 CSC-TPDC (איור 4). יתר על כן, היה ייצור IgG גבוה יותר באופן משמעותי (p<0.05) על ידי תאי טחול פעילים LPS/anti-CD40 שנאספו מבעלי החיים שחוסנו עם D5 CSC-TPDC או SCC7 CSC-TPDC בהשוואה ל- D5 H-TPDC או SCC7 H-TPDC. נוגדנים אלה נמצאו להיקשר D5 ו SCC7 CSCs בהתאמה, מחייב כזה יכול לגרום תמוגה CSC בנוכחות משלים8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> איור 1. ALDHFLUOR +/ALDH אוכלוסיותגבוהות זוהו בתרבית, כמו גם לאחרונה שנקטפו מלנומה מורין D5 טריים וגידולי תא קשקש SCC7. תאים סרטניים שטופלו 50 mmol / L DEAB, מעכב ALDH ספציפי, שימשו כפקד שלילי.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> איור 2. דור של חיסונים מבוססי תאים דנדריטיים לתאי גזע סרטניים. להכנת CSC-TPDC ו H-TPDC, תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם היו פעמו עם ALDHגבוה או לא ממוין תאי הגידול lysates, בהתאמה.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> איור 3. CSC lysate פעמו DC (CSC-TPDC) חיסון יכול לגרום יעיל יותר הגנה antitumor חסינות s.c. דגם גידול SCC7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> איור 4. תגובות תאיות מערכתיות חזקות יותר במארח חיסוני מחוסן עם CSC-TPDC.  טחולים נקצרו מבעלי החיים שנחשפו לחיסון H-TPDC או CSC-TPDC, והופעלו כאמור. לאחר מכן נאספו סופרנטנטים תרבותיים לגילוי ציטוקינים באמצעות ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells at JoVE.com

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

מוערך במארחים חיסוניים סינגניים, תא גזע סרטני (CSC) מבוסס תאים דנדריטיים (DC) החיסון הפגין חסינות antitumor גבוהה משמעותית מאשר חיסונים DC מסורתיים פעמו עם תאים סרטניים בתפזורת הטרוגנית.

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...