Name: generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00
Duration: 12 min 43 s
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इस काम को मिशिगन विश्वविद्यालय के व्यापक कैंसर केंद्र के विल और जीन काल्डवेल संपन्न अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित किया गया था और एनआईएच ग्रांट CA82529 और गिलसन लॉन्गेनबॉग फाउंडेशन द्वारा भाग में।

1. ALDEFLUOR धुंधला
<ol><li>सेल नमूना तैयारी: ट्यूमर कोशिकाओं के एकल सेल निलंबन तैयार करें, या तो सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं से या हौसले से काटे गए ट्यूमर के नमूनों से। कोशिकाओं की गणना करें और सेल निलंबन को ALDEFLUOR परख बफर में 1 x10 6 कोशिकाओं/मिलीलीटर की एकाग्रता में समायोजित करें ।</li>
	<li>लेबल चार 12 मिमी x 75 मिमी पॉलीस्टीरिन टेस्ट ट्यूब इस प्रकार नियंत्रण ट्यूब के रूप में: #1: अन दाग, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR प्लस DEAB, और #4: 7AAD।</li>
	<li>इन नियंत्रण ट्यूबों के लिए, 1 मिलीलीटर सेल निलंबन को #1 और #4 में रखें, लेकिन ट्यूब #2 में 2 मिलीलीटर। ट्यूब #3 में 5 माइक्रोन डीएबी (ALDH अवरोधक) जोड़ें और बर्फ पर रखें। फिर ट्यूब #2 में 10 माइक्रोन सक्रिय ALDEFLUOR सब्सट्रेट जोड़ें, मिश्रण करें और तुरंत मिश्रण के 1 मिलीलीटर को ट्यूब #3 में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>इसके साथ ही, ALDEFLUOR परख बफर में 1 x 10 6 कोशिकाओं/एमएल पर भी शेष कोशिकाओं (नमूना ट्यूब) में प्रति मिलियन कोशिकाओं में2 माइक्रोन सक्रिय ALDEFLUOR सब्सट्रेट जोड़ें ।</li>
	<li>37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 30 मिनट के लिए 4 नियंत्रण ट्यूब और नमूना ट्यूब दोनों को इनक्यूबेट करें।</li>
	<li>इनक्यूबेशन के बाद, नियंत्रण ट्यूब #4 में 5 μl 7AAD जोड़ें, और नमूना ट्यूब के लिए 1 μl 7AAD 1 x 106 कोशिकाओं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट इनक्यूबेट।</li>
	<li>250 x g पर 5 मिनट के लिए सभी ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें और सुपरनैंट निकालें।</li>
	<li>ALDEFLUOR परख बफर में कोशिकाओं को फिर से पेंड करें।</li>
	<li>फ्लो साइटोमेट्री-आधारित छंटाई करें।</li>
	<li>एडीबीबी के साथ नकारात्मक नियंत्रण और व्यवहार्यता नियंत्रण के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) 7AAD-दाग कोशिकाओं का उपयोग करके छंटाई द्वार सेट करें। इन नियंत्रणों के आधार पर, ALDEFLUOR +/ALDHउच्च,D5 और SCC7 कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक गेट की स्थापना की गई थी । इसके बाद इन गेटों का इस्तेमाल ALDEFLUOR+/ALDHहाई डी5 और एससीसी7 सेल्स के लिए ऊपर तैयार सभी सैंपल सेल को सॉर्ट करने के लिए किया जाएगा ।</li>
</ol>2. कैंसर स्टेम सेल Lysate-पल्स Dendritic सेल (सीएससी-टीपीडीसी) वैक्सीन की तैयारी
<ol><li>सीओ2 का उपयोग करके चूहों (सिंजेनिक बी 6 और सी 3एच, क्रमशः) को इच्छामृत्यु दें और फीमर और टिबिया हड्डियों को अलग करें।</li>
	<li>कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में हड्डियों को रखें। इसके बाद एचबीएसएस का इस्तेमाल कर हड्डियों को धोएं।</li>
	<li>हड्डियों से सिर काटें और कोशिकाओं को डिश में पुश करने के लिए 21 जी सुई और 10 मिलीलीटर सिरिंज का इस्तेमाल करें ।</li>
	<li>एकल कोशिका निलंबन बनाने के लिए सिरिंज का उपयोग करके कोशिकाओं को एस्पिरेट करें और उड़ाएं।</li>
	<li>5 मिनट के लिए 1,500 आरपीएम में अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को त्यागें। इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस वाटर बाथ में 1 मिनट के लिए आरबीसी को लाइसिस करने के लिए 5 एमएल आरबीसी लाइसिस बफर डालें।</li>
	<li>सेल नंबर गिनें और सेल सस्पेंशन को कंप्लीट मीडियम (सीएम) में १,०,० सेल्स/एमएल की सांद्रता में एडजस्ट करें जिसमें 10 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ और 10 एनजी/एमएल आईएल-4 होते हैं ।</li>
	<li>3 दिन बाद सेल को कल्चर करें और सीएम प्लस आईएल-4 और जीएम-सीएसएफ को मुआवजा दें।</li>
	<li>5वें दिन, अपरिपक्व डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) की कटाई करें और डीसी आइसोलेशन माध्यम तैयार करें जिसमें 4.2 मिलीलीटर समाधान सी प्लस 1 एमएल ऑप्टिप्प घनत्व ढाल माध्यम है।</li>
	<li>5 मिलीलीटर सीएम में सेल छर्रों को निलंबित करें। सेल निलंबन को धीरे-धीरे आइसोलेशन माध्यम पर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2,000 आरपीएम पर सेंट्रलाइज।</li>
	<li>सीएम और आइसोलेशन मीडियम के बीच डीसी को कलेक्ट करें। सेल नंबर गिनें और 10 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ और 10 एनजी/एमएल आईएल-4 युक्त कल्चर मीडियम में १,०००,० कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए सेल सस्पेंशन को एडजस्ट करें ।</li>
	<li>संस्कृति माध्यम में एएलडीएचउच्च या अनसोर्ट डी 5 या एससीसी7 कोशिकाओं को निलंबित करके ट्यूमर को तैयार करें और चार बार तेजी से फ्रीज-गल एक्सपोजर के अधीन करें और इसके बाद लाइसेट्स के झिल्ली भाग को इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए ∼100 x g पर स्पिन करें।</li>
	<li>सीएससी-टीपीडीसी तैयार करना, पल्स डीसी को ऑटोलॉगस एएलडीएचहाई सेल के लजीज होने के साथ। एच-टीपीडीसी तैयार करने के लिए, बिना ढके विषम ट्यूमर सेल के साथ पल्स डीसी। डीसी से लेकर ट्यूमर सेल लाइसेट तक का अनुपात एक ही है।</li>
</ol>3. टीकाकरण और प्रभावकारिता का मूल्यांकन
<ol><li>2,500 डी 5 सीएससी-टीपीडीसी या डी 5 एच-टीपीडीसी ट्यूमर कोशिकाओं के साथ क्रमशः सामान्य बी 6 चूहों को टीका लगाएं(एस.c)। क्रमशः 5,000 एससीसी 7 सीएससी-टीपीडीसी या एससीसी 7 एच-टीपीडीसी ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सामान्य C3H जानवरों एस.c टीका।</li>
	<li>टीकाकरण के बाद, विषम D5 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ B6 चूहों को चुनौती दें। फेफड़ों की कटाई करें और फेफड़ों के मेटास्टेस की गणना करें।</li>
	<li>SCC7 मॉडल में, डीसी वैक्सीन के विपरीत पक्ष पर unsorted SCC7 ट्यूमर कोशिकाओं एस.c के साथ C3H चूहों को चुनौती । ट्यूमर के आकार की निगरानी करें।</li>
	<li>प्रयोगों के अंत में सीओ2का उपयोग कर B6 और C3H चूहों इच्छामृत्यु । पहले टीके के बाद 34 दिन में, सीओ2के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें, और साथ ही प्रत्येक समूह की तिल्ली को एक एसेप्टिक प्रक्रिया के साथ एकत्र करें।</li>
	<li>सीएम में स्थिर एंटी-सीडी 3 प्लस एंटी-सीडी28 एमएबी के साथ तिल्ली टी और/या बी कोशिकाओं को सक्रिय करें जिसमें एचआरआईएल-2 या एलपीएस प्लस एंटी-सीडी40 (FGK45) mAb ascites होता है ।</li>
	<li>सक्रियण के बाद, सुपरनेटेंट एकत्र करें और एलिसा परख के लिए उपयोग करें।</li>
	<li>एलिसा परख के लिए, IFNγ के लिए एंटीबॉडी के साथ कोट प्लेटें, जीएम-सीएसएफ और आईजीजी 4 डिग्री सेल्सियस O/N पर ।</li>
	<li>बफर अवरुद्ध के आवेदन के बाद, नमूने और मानकों को जोड़ने और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।</li>
	<li>प्लेट को धोएं और इनक्यूबेशन के लिए एचआरपी डिटेक्शन एंटीबॉडी और टीएमबी सब्सट्रेट जोड़ें।</li>
	<li>प्रतिक्रिया को रोकने के बाद 30 मिनट के भीतर 450 एनएम पर एक एलिसा प्लेट रीडर पर अवशोषण को मापें।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

स्टेमसेल टेक्नोलॉजीज ने ओपन एक्सेस पब्लिकेशन फीस का समर्थन किया है ।

इम्यूनोसमझौता मेजबान, जैसे SCID चूहों, मेजबानों के भीतर अनुकूली प्रतिरक्षा की कमी के कारण सीएससी के प्रतिरक्षा आकलन को बाधित करते हैं । इस अध्ययन में, हमने इम्यूनोसंटिव मेजबानों में सीएससी की इम्यूनोजेनिसिटी का मूल्यांकन किया, जो रोगी सेटिंग्स की अधिक बारीकी से नकल कर सकता है। समृद्ध सीएससी इम्यूनोजेनिक होते हैं और अधिक प्रभावी ट्यूमर सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा को प्रेरित कर सकते हैं जब उनके लाइसेट्स को अचयनित ट्यूमर सेल लाइसेट-स्पंदित डीसी की तुलना में टीके के रूप में डीसी को लोड किया जाता है।  मशीनी रूप से, सुरक्षा सीएससी-प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी और टी कोशिकाओं8 के चयनात्मक प्रेरण के साथ-साथ टाइप 1 साइटोकिन के उत्पादन, जैसे IFNγ और जीएम-सीएसएफ द्वारा प्रदान की गई थी।
डेंड्रिटिक सेल आधारित टीकों और दत्तक टी सेल हस्तांतरण सहित अधिकांश वर्तमान इम्यूनोथेरपी, ट्यूमर-विभेदित एंटीजन को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। सीएससी, जो इन विभेदित एंटीजन को व्यक्त नहीं कर सकते हैं, इसलिए इन इम्यूनोलॉजिकल लक्ष्यीकरण से बच सकते हैं । इसके विपरीत, सीएससी टीका विशेष रूप से कैंसर स्टेम कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन कैंसर कोशिकाओं की इस विशेष आबादी को नष्ट कर सकते हैं, और इस तरह ट्यूमर पतन और मेटास्टेसिस को रोकने के द्वारा वैक्सीन की चिकित्सीय प्रभावकारिता में सुधार ।
दोनों सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं और हौसले से काटा ट्यूमर में, हम उच्च एल्डिहाइड dehydrogenase गतिविधि के आधार पर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सीएससी समृद्ध आबादी की पहचान की । इस तरह के ALDHउच्च कोशिकाओं को प्रवाह छंटाई द्वारा अलग किया जा सकता है सीएससी-TPDCs उत्पन्न करने के लिए पल्स डीसी के लिए एक एंटीजन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । ताजा काटा ट्यूमर से बनाम सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं से अलग ALDHउच्च कोशिकाओं का उपयोग कर तुलना विरोधी सीएससी प्रतिरक्षा8के प्रेरण की अवधि में कोई महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया । इन परिणामों को या तो सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं से या नैदानिक आवेदन के लिए हौसले से काटा ट्यूमर से अलग CSCs का उपयोग करने की क्षमता का पता चला ।
चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक होने के लिए, एक टीके की चिकित्सीय सेटिंग में जांच करने की आवश्यकता होती है। ये प्रयोग अब हमारी प्रयोगशाला में किए जा रहे हैं।

कैंसर स्टेम सेल पारंपरिक कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी1,2के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी हैं। दूसरी ओर, कोशिकाओं की यह आबादी पारंपरिक कैंसर चिकित्सा1-4के बाद कैंसर के पतन और प्रगति के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं हो सकता है । कैंसर स्टेम कोशिकाओं पर विभेदित ट्यूमर एंटीजन की अभिव्यक्ति की कमी के कारण, कैंसर स्टेम सेल कैंसर के लिए चिकित्सा के वर्तमान इम्यूनोलॉजिक हस्तक्षेप से बच सकते हैं, जो ज्यादातर विभेदित ट्यूमर कोशिकाओं पर एंटीजन को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं । इसलिए, नई रणनीतियों के विकास विशेष रूप से लक्षित और कैंसर स्टेम कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए वर्तमान कैंसर के इलाज की चिकित्सीय प्रभावकारिता बढ़ाने का वादा पकड़ सकता है । इस उद्देश्य के लिए, हमने कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) को दो पशु ट्यूमर (मेलानोमा डी 5 और स्क्वैमस सेल कैंसर एससी 7) से समृद्ध आबादी को अलग किया, और सीएससी-टीपीडीसी वैक्सीन तैयार करने के लिए उन्हें पल्स एंटीजन पेश करने वाली कोशिकाओं (डेंड्रिटिक सेल, डीसी) के लिए एक एंटीजन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया। इसके बाद हमने सिनेजेनिक इम्यूनोसंपिटेंट मेजबानों, बी 6 चूहों और C3H चूहों में सीएससी-टीपीडीसी वैक्सीन द्वारा प्रेरित एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा का मूल्यांकन किया। सीएससी-टीपीडीसी-प्रेरित एंटीट्यूमर प्रभावकारिता की तुलना पारंपरिक डीसी वैक्सीन के साथ की गई थी, जिसे अनसंबंधित विषम ट्यूमर कोशिकाओं (एच-टीपीडीसी) से लाइसेट के साथ स्पंदित किया गया था, जिसका उपयोग पहले हमारे समूह5,6द्वारा किया जाता था, साथ ही अन्य जांचकर्ताओं द्वारा7 दोनों प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में और नैदानिक परीक्षणों में।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

हमने कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की पहचान की- मुरीन मेलानोमा डी 5 सिनेजेनिक से C57BL/6 चूहों तक समृद्ध आबादी और एक मार्कर के रूप में ALDEFLUOR/ALDH का उपयोग करके C3H चूहों को स्क्वैमस कैंसर SCC7 सिनेनिक, और पल्स के लिए एंटीजन के स्रोत के रूप में सेल lysate का उपयोग कर उनकी इम्यूनोजेनिसिटी का परीक्षण किया (डीसी) । एएलडीएचउच्च सीएससी लाइसेट्स के साथ स्पंदित डीसी ने दोनों मॉडलों में और फेफड़ों के मेटास्टेसिस सेटिंग और एस.c में अनसोर्ट्ड पूरे ट्यूमर सेल लाइसेट्स के साथ स्पंदित डीसी की तुलना में काफी अधिक सुरक्षात्मक एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा को प्रेरित किया। ट्यूमर विकास सेटिंग, क्रमशः। यह घटना सीएससी वैक्सीन-प्रेरित ह्यूमरल के साथ-साथ सेलुलर एंटी-सीएससी प्रतिक्रियाओं के कारण हुई थी। विशेष रूप से, सीएससी-डीसी वैक्सीन के अधीन मेजबान से अलग किए गए स्प्लेनोसाइट्स ने मेजबान से अलग किए गए स्प्लेनोसाइट्स की तुलना में IFNγ और जीएम-सीएसएफ की काफी अधिक मात्रा का उत्पादन किया। ये परिणाम एक सहायक सेटिंग में नैदानिक उपयोग के लिए एक ऑटोलॉगस सीएससी-आधारित चिकित्सीय टीका विकसित करने के प्रयासों का समर्थन करते हैं।

ALDEFLUOR/ALDH एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है कई घातक8-11में स्टेम कोशिकाओं को अलग । हम एक मार्कर के रूप में ALDEFLUOR का उपयोग करके दो ट्यूमर मॉडल D5 और SCC7 में कैंसर स्टेम सेल समृद्ध आबादी की पहचान की । हमने मुरीन मेलानोमा बी 16-डी 5 और स्क्वैमस सेल कैंसर एससीसी 7 में ALDEFLUOR + कोशिकाओं का पता लगाया। हमने पाया कि ALDEFLUOR + कोशिकाओं को क्रमशः सुसंस्कृत D5 और SCC7 ट्यूमर सेल लाइनों में लगभग ०.५% और५.२% योगदान, (चित्रा 1)। स्थापित ट्यूमर से ताजा काटा ट्यूमर कोशिकाओं ALDEFLUOR + कोशिकाओं के अस्तित्व की पुष्टि करने के लिए विश्लेषण किया गया है । जैसा कि चित्रा 1में भी दिखाया गया है, वीवो स्थापित डी 5 और एससीसी 7 ट्यूमर में से ALDEFLUOR + कोशिकाओं के क्रमशः 2.5% और 4.2% थे। ट्यूमरजनकता और इन हल D5 और SCC7 ALDEFLUOR +/ALDHउच्च आबादी की आत्म नवीकरण क्षमता सिनेजेनिक इम्यूनोसंडेंट मेजबान, C57BL/6 और C3H चूहों, क्रमशः8में मूल्यांकन किया गया ।
हमने पशु अध्ययन और नैदानिक परीक्षणों5,6दोनों में पल्स डीसी (एच-टीपीडीसी) के लिए विषम अनसोजेनियस अनसोर्ट ट्यूमर सेल का उपयोग किया है। सीएससी की इम्यूनोजेनिसिटी की जांच करने के लिए, हमने सीएससी-टीपीडीसी(चित्रा 2)उत्पन्न करने के लिए सीएससी के लाइसेट के साथ एएलडीएचउच्च सीएससी और स्पंदित डीसी को अलग किया और एच-टीपीडीसी को पारंपरिक कैंसर वैक्सीन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि क्या सीएससी-टीपीडीसी का ट्यूमर के विकास को रोकने में कोई लाभकारी प्रभाव पड़ता है ।
हमने सीएससी-टीपीडीसी द्वारा प्रेरित सुरक्षात्मक एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा की जांच करके सीएससी की इम्यूनोजेनिसिटी का मूल्यांकन किया। डी5 मॉडल में, भोली इम्यूनोसंप्यूटेंट चूहों को सीएससी-टीपीडीसी या एच-टीपीडीसी (एक ही समय में: डीसी अनुपात) के साथ टीका लगाय.c ा गया था। नियंत्रण समूहों को खारा (पीबीएस) प्राप्त हुआ । पिछले टीके के एक सप्ताह बाद, चूहों को अनसोर्टेड डी 5 ट्यूमर कोशिकाओं के साथ नसों में(i.v.)के साथ चुनौती दी गई थी, और फेफड़ों को 3 सप्ताह बाद फेफड़ों के मेटास्टेस की गणना करने के लिए काटा गया था। जैसा कि पीबीएस समूह की तुलना में तालिका 1में दिखाया गया है, एच-टीपीडीसी के साथ इलाज किए गए चूहों ने फेफड़ों के मेटास्टेस कम विकसित किए। महत्वपूर्ण बात यह है कि सीएससी-टीपीडीसी के साथ इलाज किए गए चूहों में दोनों प्रयोगों में एच-टीपीडीसी वैक्सीन समूह की तुलना में काफी कम फेफड़ों के मेटास्टेस थे । SCC7 मॉडल में, सामान्य C3H जानवरों को क्रमशः सही पार्श्व पर SCC7 CSC-TPDC या H-TPDC के साथ एस.c टीका लगाया गया था, जिसके बाद बाएं पार्श्व में अनसॉर्टीकृत एससीसी 7 ट्यूमर कोशिकाओं एस.c के साथ चुनौतीपूर्ण था। पीबीएस समूह के साथ तुलना में, एच-टीपीडीसी ट्यूमर के विकास के खिलाफ मामूली विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रेरित । हालांकि, चूहों में ट्यूमर के विकास का महत्वपूर्ण अवरोध था जिसका इलाज सीएससी-टीपीडीसी के साथ किया गया था, जब नियंत्रण समूह और एच-टीपीडीसी समूह (पी<0.05, चित्रा 3)दोनों के साथ तुलना की गई थी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि सीएससी को ट्यूमर कोशिकाओं की चुनौती के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा उत्प्रेरण में पारंपरिक अनसोर्ट ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में डीसी लोड करने के लिए एक अधिक प्रभावी एंटीजन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
मनाया सीएससी प्रेरित सुरक्षात्मक एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, हम प्रयोगों के अंत में डीसी टीकाकरण के अधीन जानवरों से प्लीहा काटा । इसके बाद तिल्ली कोशिकाओं को एंटी-सीडी 3/सीडी28/आईएल-2 या एंटी-सीडी 3/सीडी28/आईएल-2 + एलपीएस/एंटी-सीडी40 द्वारा सक्रिय किया गया । फिर साइटोकिन्स और एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए संस्कृति सुपरनेटेंट एकत्र किए गए।  D5 सीएससी-टीपीडीसी या एससीसी 7 सीएससी-टीपीडीसी(चित्रा 4)के साथ टीका लगाए गए जानवरों से तिल्ली कोशिकाओं द्वारा IFNγ और जीएम-सीएसएफ की काफी अधिक प्रस्तुतियां थीं। इसके अलावा, डी5 एच-टीपीडीसी या एससीसी 7 एच-टीपीडीसी की तुलना में डी5 सीएससी-टीपीडीसी या एससीसी-टीपीडीसी के साथ टीका लगाए गए जानवरों से एकत्र की गई एलपीएस/एंटी-सीडी40 सक्रिय तिल्ली कोशिकाओं द्वारा काफी (पी<0.05) उच्च आईजीजी उत्पादन था । इन एंटीबॉडी को क्रमशः डी 5 और एससीसी 7 सीएससी से बांधने के लिए पाया गया था, और इस तरह के बाध्यकारी पूरक8की उपस्थिति में सीएससी लाइसिस में परिणाम सकता है ।
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> चित्रा 1. ALDHFLUOR +/ALDHउच्च आबादी सुसंस्कृत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नए काटा ताजा murine D5 मेलानोमा और SCC7 स्क्वैमस सेल ट्यूमर में पाया गया । ट्यूमर कोशिकाओं ५० mmol/L DEAB, एक विशिष्ट ALDH अवरोधक के साथ इलाज किया, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया ।
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> चित्रा 2। डेंड्रिटिक सेल आधारित कैंसर स्टेम सेल टीकों का उत्पादन। सीएससी-टीपीडीसी और एच-टीपीडीसी की तैयारी के लिए बोन मैरो से व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाओं को क्रमशः एएलडीएचहाई या अनसोल्ड ट्यूमर सेल लाइसेट्स के साथ स्पंदित किया गया था ।
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<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> चित्र 3। सीएससी लित स्पंदित डीसी (सीएससी-टीपीडीसी) वैक्सीन एस.c में अधिक प्रभावी सुरक्षात्मक एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा को प्रेरित कर सकती है। SCC7 ट्यूमर मॉडल। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> चित्र 4. इम्यूनोसंटिव होस्ट में अधिक शक्तिशाली प्रणालीगत सेलुलर प्रतिक्रियाएं सीएससी-टीपीडीसी के साथ टीका लगाया गया।  Splenocytes एच-टीपीडीसी या सीएससी-टीपीडीसी टीकाकरण के अधीन जानवरों से काटा गया था, और संकेत के रूप में सक्रिय थे । तब एलिसा का उपयोग करके साइटोकिन डिटेक्शन के लिए संस्कृति सुपरनेटेंट एकत्र किए गए थे।
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Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

सिनेजेनिक इम्यूनोसंट्यूड मेजबानों में मूल्यांकन किया गया, कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) आधारित डेंड्रिटिक सेल (डीसी) वैक्सीन ने विषम थोक ट्यूमर कोशिकाओं के साथ स्पंदित पारंपरिक डीसी टीकों की तुलना में काफी अधिक एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा का प्रदर्शन किया।

मेलानोमा और स्क्वैमस कैंसर स्टेम सेल का उपयोग करके एक उपन्यास डेंड्रिटिक-सेल वैक्सीन की पीढ़ी

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

घायल प्रवाह cytometry द्वारा स्पाइनल कॉर्ड ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन: एक सेल शोधन विधि के लिए एक उपन्यास का प्रयोग करें

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

एलर्जी airway सूजन फेफड़े के वृक्ष के समान सेल परिपक्वता और प्रवासन के दौरान विश्लेषण

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipid प्रतिजनों के बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

मेजर multicenter चिकित्सीय परीक्षण के लिए परिधीय रक्त ल्युकोसैट आबादी एक पूरे रक्त phenotyping परख का उपयोग कर की गणना

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

का उपयोग करते हुए निगरानी वृक्ष के समान सेल प्रवासन<sup&gt; 19</sup&gt; एफ /<sup&gt; 1</sup&gt; एच चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

एफडीए को मंजूरी दी वेरो कोशिकाओं में टीके के विकास के लिए संयोजक arenavirus की पीढ़ी

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

शुद्ध hematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में डीएनए म्यूटेशन की पहचान

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

मेजबान सेल शाही सेना संश्लेषण पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान का प्रयोग

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

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The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...