Name: proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Forfatteren takker Dr. Matthias Mann for den fortsatte støtte og Fru Katharina Zettl for at demonstrere metoden. Dette arbejde blev støttet af Max-Planck Society for Advancement of Science.

1.. Instrumentering kræves <ol><li> Udarbejdelse af vævssnit til mikrodissektion og prøve lysis <ol><li> Thermoblock indstillet til 99 ° C eller et bad med kogende vand. </li><li> Laser drift microdissector (f.eks PALM, Zeiss, Göttingen, Tyskland). </li><li> Termostatstyret Bordcentrifuge, temperatur indstillet til 20 ° C. </li><li> Våd kammer (box) med et rack til Eppendorf-type rør bortskaffelse. </li><li> Inkubator indstillet til 37 ° C. </li><li> Spektrofluorometer muliggør måling af fluorescens ophidset nær UV-lys med mikro-skala kvartskuvetter (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Løsninger <ol><li> &quot;Væv Lysis Buffer (TLB): 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0,5% (w / v) polyethylenglycol 20.000 og 4% SDS. </li><li> UA opløsning: 8 M urinstof i 0,1 M Tris-HCI pH 8,5. Forbered 1 ml pr 1 prøve. UA og IAA-løsninger skal være forberedt frisk og anvendes inden for en dag. </li><li> IAA løsning: 0,05 M iodoacetamide i UA. Forbered 0,1 ml pr 1 prøve. </li><li> Endoproteinase Lys-C, stamopløsning. </li><li> Trypsin, stamopløsning. </li><li> &#39;Fordøjelsen buffer «(DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Forbered 0,25 ml pr 1 prøve. </li><li> &#39;Tryptophan Standard Løsning&#39;: 0,1 ug tryptophan i 1 ml deioniseret vand. </li><li> &#39;Assay buffer B (ABB): 10 mM Tris-HCI, pH 7,6. </li><li> Stamopløsning af Britton &amp; Robinson Universal Buffer (BRUB). Forbered en opløsning indeholdende 0,1 M CH3COOH, 0,1 MH 3 PO 4 og 0,1 MH 3 BO 3 og juster med 1 M NaOH til den ønskede pH-værdi (2, 4, 5, 6 og 11). Før brug fortyndes 5 gange med deioniseret vand. </li><li> Buffer A: 1% (v / v) CH3COOH i deioniseret vand. </li><li> Buffer B: 60% (v / v) CH3CN, 1% (v / v) CH3COOH i deioniseret vand. </li></ol> 3. Pipettespids og &#39;StageTip&#39; Kolonner <ol><li> SAX tip-kolonne Forbered ved at stable 6 lag Empore-anionmembran i et samarbejdemmon 0,2 ml pipette spids. Lav to SAX-tip kolonner pr prøve. </li><li> Forbered &#39;StageTip&#39; ved at stable 3 lag Empore-C 18 i en 0,2 ml pipette spids. Lav 6 Stage tips til hver prøve. </li></ol> 4.. Udarbejdelse af vævssnit til mikrodissektion og Sample Lysis <ol><li> Snit med en mikrotom (tykkelsen af ​​skiverne afhænger af prøven. Normalt mikrodissektion fungerer godt med skiver på 7-10 um). </li><li> Bestråle membran slides (MembraneSlide 1.0 PEN) med UV-lys i 45 min. </li><li> Monter afsnittene om de bestråle membran dias og tør ved 37 ° C i 2 timer. </li><li> Afparaffiner de monterede sektioner ved to på hinanden følgende inkubationer i xylen i 2,5 min og 1,5 min. Rehydrere sektioner ved fortløbende inkubationer i absolut ethanol, 70% ethanol, og vand, hver til 1 min. </li><li> Farv afsnittene med Mayers hæmatoxylin for 20 sek, skyl med vand i 1 min, og lufttørre. </li><li> Saml celle populatiom renter ved hjælp af laser capture microdissection system. Når du bruger PALM instrument (Zeiss) indsamle prøverne i de klæbende hætter (Adhesive CAP 200). </li><li> Pipette en alikvot af TLB over mikrodissekeres materiale i hætten. Luk glasset og indsamle suspensionen med en kort centrifugering. Lyse den Mikrodissekterede væv ved 99 ° C i en varmeblok med omrøring (600 rpm) i 1 time. Brug 3 pi puffer i 10 nl af Mikrodissekterede væv. </li><li> Tydeliggøre råekstrakt ved centrifugering ved 16.000 x g ved 18 ° C i 10 min. Lysatet kan opbevares frosne ved -20 ° C. </li></ol> 5.. Prøve behandling <ol><li> Bland op til 50 ul af den klarede lysat med 200 pi UA i ultrafiltrering enheder (Forensic 30k) og centrifugeres ved 14.000 xg, indtil mindre end 10 ul af opløsningen forbliver i filteret. Normalt dette trin kræver 10-15 min centrifugering. </li><li> Pipettere 200 pi UA til ultrafiltreringsenhedenog centrifuger som i 5.1. Tøm opsamlingsrøret. </li><li> Pipetter 50 pi IAA saltsyre og blandes ved 600 rpm i en termo-mixer til 1 min og centrifuger som i 5.1. </li><li> Tilsæt 100 ul UA til ultrafiltreringsenheden og centrifuger som i 5.1. Gentag dette trin to gange </li><li> Der afpipetteres 100 ul af BF til ultrafiltreringsenheden og centrifuger ved i 5.1. Gentag dette trin to gange. </li><li> Overfør filtreringsenheder til nye rør indsamling. Pipetten 40 pi DB med endoproteinase Lys-C (proteinase til total protein-forhold på 1:100) og bland ved 600 rpm i termo-blander i 1 minut. Inkuber enheder i et vådt kammer ved 37 ° C i 18 timer. </li><li> Centrifuger filterenhederne på 14.000 xg som i 5.1. </li><li> Pipetter 160 ul deioniseret vand og centrifuger filter enheder som i 5.1. Det samlede gennemstrømning (5.7 og 5.8 trin) indeholder peptiderne frigives ved endoproteinase Lys C. </li><li> Overfør ultrafiltreringsenhed til en ny opsamlingsrør. Tilsæt 40 ​​ulDB med trypsin (enzym til protein-forhold 1:100) og bland ved 600 rpm i termo-blander i 1 minut. Inkuber enheder i et vådt kammer ved 37 ° C i 4 timer. Gentag trin 5.7 og 5.8 for at indsamle de tryptiske peptider. </li></ol> 6.. Kvantificering af peptiderne <ol><li> Målingen af ​​peptidet indhold i protein fordøjelser kan udføres i fortyndet buffer fordi tryptophanrester er godt tilgængelige for opløsningsmidlet. </li><li> Pipette 0,2 ml ABB i kvartskuvette og registrere emissionsspektrum for &quot;blank&quot;. </li><li> Forbered kalibreringskurve ved brug 0,1 ug trin ved at tilsætte 1 ml portioner af TSS til kuvetten og blid blanding med ABB. </li><li> Rengør kuvette. </li><li> Pipette prøven og optage spektret (prøve). </li><li> Beregn af proteinet og peptidkoncentration Siden 0,1 ug tryptophan svarer til omkring 9 ug protein (baseret på den gennemsnitlige 1,1% af indholdet af tryptofan i proteinblandinger opnået by lysering humane celler) proteinindholdet af i prøven eller peptid-indholdet i det fordøjede lig med: <img alt="Ligning 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> hvor F (standarden1) er den fluorescens på 0,1 ug tryptophan standard. Indholdet peptid muliggør beregning af udbyttet af fordøjelsen procedure og giver væsentlig information til følgende peptid fraktionering og massespektrometrisk analyse. </li></ol> 7.. Fraktionering af det Lys-C og Tryptiske peptider <ol><li> Fortynd peptid løsninger opnået ved fordøjelse med Lys-C og trypsin med 0,2 ml BRUB pH 11 og pH 5, hhv. </li><li> Saml SAX tip-kolonne i centrifugal rør adapter låg. </li><li> Vask og tempereres SAX-tip-kolonnen successivt med 0,1 ml methanol, 0,1 ml 1 M NaOH og 3 gange med 0,1 ml BRUB, pH 11 til separation af Lys-C peptides og med BRUB, pH 5 for de tryptiske peptider. Strømmen af ​​løsninger gennem søjlematerialet lettes ved centrifugering ved 4.000 x g. </li><li> Vask og tempereres C 18 - »StageTips &#39;efterfølgende med, 0,05 ml methanol, derefter med 0,05 ml puffer B og med 0,05 ml Buffer A. Forbered seks C 18 -» StageTips «4 for adskillelse af Lys- C peptider og to for adskillelse af de tryptiske peptider. </li><li> Saml SAX Tip-kolonne i C 18 - &#39;StageTip &quot;. Læg de Prøveopløsningerne ind i de ækvilibrerede SAX TIP-søjler og centrifuger kolonnerne ved 5.000 xg i 3 min. </li><li> Ækvilibrere &#39;pipette-spids&#39; kolonner med 0,1 ml af BRUB, pH 11 eller pH 5, henholdsvis til Lyc-C og tryptiske prøver. Lette strømmen ved centrifugering ved 5000 x g. </li><li> Overfør SAX Tip-kolonne til den næste C 18 - &#39;StageTip &quot;. </li><li> Fortsæt eluerende af peptider med BRUB pH 6, 4 og 2 for Lys C prøven og med BRUB pH 2 for prøven med tryptiske peptider. For hvert elueringstrin bruge en separat C18 - »StageTip. </li><li> Vask C 18 - »StageTips&quot; med 0,05 ml buffer A. </li><li> Eluer fraktioner med 0,05 ml Buffer B i hætteglas, som anvendes direkte til injektion af prøverne i LC-system samlet med et massespektrometer. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

Forfatteren har ikke noget at afsløre.

Evnen til at studere FFPE materiale ved proteom-teknologi til en dybde sammenlignes med nukleinsyresekventering og microarray-teknikker åbner nye perspektiver i biomarkør og drug target discovery. Den beskrevne protokol muliggør karakterisering og kvantificering af proteomer af populationer af Mikrodissekterede celler på en skala fra 10.000 proteiner. Når du bruger mindre af den mikrodissekeres materiale en mindre datasæt kan genereres, men måske i mange tilfælde dem, kan også give værdifulde kliniske data. Således kan enten prøverne analyseres direkte efter MED-FASP procedure eller kan adskilles i mindre fraktioner. Da FASP procedure er kompatibel med enhver form for protease kan andre enzymer eller deres kombination bruges fra protein digestions 6. Kvaliteten af ​​FFPE materiale synes at være den mest kritiske spørgsmål for analysen. Vi har oplevet, at den faste væv af samme oprindelse, men kommer fra forskelligENT klinikker havde særlige egenskaber. Brug væv fra en kilde, vi var i stand til at generere peptider ved høje udbytter, mens lignende materiale fra en anden klinik var næsten ubrugelig. Det er sandsynligt, at det ansøgte fiksering og forankring procedurer samt opbevaringsforholdene er de vigtigste faktorer, der påvirker egenskaberne af det kliniske materiale 12. Derfor er det tilrådeligt at teste egenskaberne af få prøver, før du starter et større projekt. Mange publikationer rapporterede anvendelsen af ​​FFPE materiale i fortiden. Antallet af identificerede proteiner i disse undersøgelser oversteg aldrig mere end 1000-2000 proteiner 4. I betragtning af størrelsen af ​​de menneskelige celle specifikke proteomer omfatter mere end 10.000 proteiner, sådanne undersøgelser var kun i stand til at give et meget overfladisk billede, næsten begrænset til meget rigelige proteiner involveret i rengøring funktioner. Vores protokol muliggør effektiv isolering af kliniske eller biologiske materiale from konserverede væv og er optimeret til lysis, protein forarbejdning og peptid præfraktionering. Som en konsekvens vores prøveforberedelse arbejdsgang, når den er koblet til den høje ende massespektrometri giver indsigt i en næsten komplet proteomer. Bemærkelsesværdige, er dette muligt ved minut prøvemængde krav. Den største fordel ved at anvende de bevarede væv er deres relative bred tilgængelighed. FFPE prøver arkiveres i mange år og årtier, og undertiden betragtes som ubrugelig, nu, takket være proteom-teknologi, fremstår som meget værdifuldt materiale til klinisk forskning. Mens mange sygdomme kan studeres ved hjælp af friske eller frosne materiale undersøgelse af FFPE materiale synes at være særligt vigtigt for at studere sjældne sygdomme 12, var opkrævningen af et repræsentativt sæt prøve tager normalt lang tid.

Fastsættelse med paraformaldehyd og indstøbning i paraffin (FFPE) er den standard metode til konservering og pathomorphologic undersøgelse af klinisk vævsmateriale. Mikroskopi af den bevarede væv muliggør identifikation af sygdomsrelaterede morfologiske ændringer, og detektering og scoring af forekomsten af ​​sygdomsrelaterede antigener. Da der typisk kun en lille del af FFPE prøven anvendes i disse analyser, store mængder af klinisk materiale forblive arkiveret og kan udnyttes i andre typer af undersøgelser. Under den seneste tiår forskningen i biovidenskab er blevet styrket af den magtfulde proteom-teknologi. Denne teknologi muliggør identifikation og kvantificering af tusindvis af proteiner i komplekse proteinblandinger. Et vigtigt træk ved teknologien er, at der er behov for kun små mængder af materiale til storstilet analyser. Nylige proteom undersøgelser viste, at proteiner kan undersøges på en skala fra næsten compLete proteomer 1, 2. Denne type undersøgelser giver hele systemet indsigt i sammensætningen af ​​cellerne og identifikation af grupper af proteiner, der forekommer på unormale niveauer i sygdomme. Disse undersøgelser kræves store massespektrometriske kapacitet, har det seneste arbejde vist, at tilsvarende omfang for identifikation kan nås inden for en enkelt dag i måling 3. Kravet om relativt lave prøvemængde og den brede tilgængelighed af de bevarede kliniske prøver fristet os og andre til at udvikle metoder, der gør det muligt proteomisk udforskning af FFPE materiale (for en gennemgang se 4). Drage fordel af reversibilitet formalinfiksering under en varmebehandling har vi udviklet en protokol tillader kvantitativ udvinding af proteiner fra den faste væv 5.. Vi har vist, at fiksering procedure bevarer ikke kun proteiner, men også i det mindste nogle posttranslationelle modifikationer. Phosphorylation og N-glycosylation kan studeres ved hjælp af FFPE prøverne 5, men en forudsætning for det er en grundigt kontrolleret væv indsamling, opbevaring og fiksering forhold. Dernæst har vi optimeret fremgangsmåde til en laser capture microdissection af fikseret væv og proteomik reaktor baseret prøve behandling 6, 7. En storstilet undersøgelse om kolorektal cancer tilladt kvantitativ analyse af 7.500 proteiner fra mikrodissekeres fra klinisk materiale 8. Endelig har vi forbedret den måde udforskning af mikrodissekeres materiale ved at anvende træk-to trin proteinfordøjelsen protokol 9. I sammenligning med de almindelige fordøjelse strategier via enkelt enzym denne fremgangsmåde muliggør produktion af flere sekvensspecifikke unikke peptider og dermed resulterer i en højere dybde af protein identifikation. Analyse af Mikrodissekterede human adenom tilladt proteom analyse til en dybde på 9.500 proteiner pr prøve 3. I denne study vi kortlagt 55.000 peptider per prøve til identifikation af 88-89% proteiner med mindst 2 peptider. Her præsenterer vi en optimeret protokol til forberedelse af prøver fra FFPE materiale til LC-MS/MS analyse. Denne protokol omfatter udarbejdelse af vævssnit til mikrodissektion lyse af de isolerede celler, og prøve behandling i en reaktor format (FASP) 6.. Derefter beskriver vi en spektrofluorometrisk bestemmelse af peptid udbytter en opgave med stor betydning for optimal peptid identifikation af massespektrometri. Endelig viser vi en stærk anionbytter (SAX)-baserede separation teknik for peptid fraktionering. I denne metode både peptidet separation og endelig oprydning er udført ved anvendelse af pipette-tip mikrosøjler 10, 11. Dette trin er valgfrit, men anbefales i undersøgelser, hvor mere end få mikrogram peptider kan opnås fra en enkelt prøve. Sax-fraktionering kan øge antallet og dynamikområde identifications og udvide det protein sekvens dækning 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Bevares klinisk materiale er en unik kilde til proteom undersøgelse af menneskelige lidelser. Her beskriver vi en optimeret protokol tillader storstilet kvantitativ analyse af formalin faste og paraffinindlejret (FFPE) væv. Proceduren består af fire adskilte trin. Den første er udarbejdelsen af ​​afsnittene fra FFPE materiale og mikrodissektion af celler af interesse. I det andet trin de isolerede celler lyseres og behandles ved hjælp &quot;filter hjulpet prøveforberedelse (FASP) teknik. I dette trin proteiner udtømt fra reagenser anvendt til prøven lysis og fordøjes i to trin med endoproteinase LysC og trypsin. Efter hver fordøjelse peptiderne opsamles i separate fraktioner, og deres indhold bestemmes ved hjælp af en meget følsom fluorescens måling. Endelig er de peptider fraktioneret på &#39;pipette-tip&#39; mikrosøjler. LysC-peptider er adskilt i 4 fraktioner mens tryptiske peptides er adskilt i to fraktioner. På denne måde fremstillede prøver tillader analyse af proteomer fra små mængder af materiale til en dybde på 10.000 proteiner. Således beskrives arbejdsgang er en kraftfuld teknik til at studere sygdomme i et system-wide-mode såvel som til identifikation af potentielle biomarkører og lægemiddelkandidater.

Proteomisk analyse af FFPE materiale kræver robuste og reproducerbare metoder til prøveforberedelse. I denne publikation vise vi en protokol tillader effektiv isolering af cellepopulationer fra det faste materiale og deres kemisk forarbejdning resulterer i høj renhed peptidfraktioner, der direkte kan bruges til LC-MS/MS analyse. Proceduren består af fire forskellige dele: (1) Fremstilling af dele af FFPE prøver og dets mikrodissektion, (2) lysis af prøven og behandlingen af ​​de proteiner, der bruger MED FASP tilgang, og (3) kvantificering og (4) fraktionering af peptiderne (figur 1). I det første trin af proceduren FFPE prøver sektioneret med en microtome og monteret på membran dækket slides. For at øge vedhæftningen mellem vævssnittene og overfladen af ​​objektglasset membranen er nødvendigt at bestråle glideflade med UV-lys. Til dette formål bruger vi på baggrund af en UV-lampeintegreret i en cellekultur bænk. Efter dette trin objektglassene underkastes vask tillader fjernelse af paraffin og rehydrering af prøverne. Den rehydrerede farves med hematoxilin for en kort tid. Dette resulterer i en svag farvning af prøven, men er tilstrækkelig til visualisering af prøvesteder til mikrodissektion. Farvningsprocessen skal stoppes hurtigt ved skylning af objektglassene med et overskud af vand. En forlænget farvning af prøveresultaterne i fattige peptid udbytter. I det næste trin de tørrede dele underkastes mikrodissektion. Udvælgelsen af ​​væv områder af de enkelte celler afhænger af den type undersøgelse og altid kræver specifik viden i histologi eller pathomorphology. Laseren-udgivet materiale opsamles på klæbende overflader af rørene prøve indsamlingsordninger. Da bindingskapacitet klæbende materiale er begrænset, er det nødvendigt at overføre Mikrodissekterede materiale fra låget til than rør efter dissektion af hver 3-5 mm 2 af prøven. Dette kan nemt gøres ved pipettering af nogle få mikroliter af vævet lysisbuffer (LTB) på låget og en kort spinding af røret i en centrifuge. Efter at prøven opsamles i bunden af ​​røret, kan mikrodissektion og prøvetagning på låget fortsættes. Når hele prøven opsamles rørene skal derudover tilproppet med Parafilm og inkuberet i et vandbad ved ca 99 ° C under kontinuerlig omrøring i 1 time. Da under inkubationen vandet kondenserer på låget, hver 15 min rørene skal være kort centrifugeret for at opsamle vandet tilbage i røret kegle. For at opnå peptider væv lysater behandles ved hjælp af MED-FASP tilgang. Ved denne metode lyserede proteiner forsvinder fra vaske-og andre lavmolekylære stoffer carboamidomethylated på cysteinylrester og derefter fortløbende fordøjet med to enzymer DIFfering i deres spaltningsprodukter særlige: endoproteinase LysC og trypsin. Efter hvert spaltningstrinnet peptiderne opsamles i separate fraktioner. I denne del af prøvefremstilling er det vigtigt at fortsætte hver af centrifugeringstrin indtil mere end 95% af den oprindeligt er indlæst i filtreringsenheden passeret membranen. Analyse colonvæv og kræft observerede vi, at denne fremgangsmåde giver 3-6 ug peptid pr 100 nl (100 ug væv eller 10 mm 2 af en 10 um sektion) i Mikrodissekterede materiale (tabel 1). Da ekstraheres totalt protein fra væv er omkring 10% af vævsvægt ekstraktion og fordøjelse procedurer tilsammen resulterer i et udbytte i forhold til den oprindelige friske væv 30-60%. Disse værdier afspejler tab af proteinet under dehydrering og farvning mikrodissektion og fastholdelse af den del af den nedbrudte prøve med de ultrafiltrering enheder. Fordi udvinding og forarbejdning af ikken-Mikrodissekterede FFPE væv resulterede i protein-til-peptid-konvertering udbytte på 75% 5 er det sandsynligt, at de kritiske tab prøve forekomme under de forskellige trin før MED-FASP. Et vigtigt træk af peptidblandinger opnået ved denne procedure er deres høje renhed, som letter yderligere fraktionering peptid fraktioneringsproces og massespektrometri identifikation. Dette er for nylig blevet vist ved en analyse af kolorektale adenom prøver 3. I denne undersøgelse omkring 40% af de begivenheder, MS / MS førte til identifikation af peptider fra FFPE væv og resulterede i kortlægning af op til 17.000 peptider pr enkelt LC-MS/MS løb. Højere identifikation satser kun være blevet opnået i analysen af frosne in vitro dyrkede celler 3. I de to sidste dele af hele proceduren De isolerede peptider kvantificeres og fraktioneret på pipette-tip mikrosøjler. Da mængden af ​​peptid isoleret fra det mikrodissekeres væv er værelav 10 ug de ikke kan kvantificeres ved hjælp af almindeligt anvendte farvestofbaseret proteinassays. Også A 280 UV-spektrale målinger på disse koncentrationer ikke er nyttige på grund af lysspredning effekt. I modsætning hertil målinger af fluorescens af tryptophanrester tilbyde en pålidelig måde til bestemmelse af indholdet af peptid. For nylig har vi vist, at op til 5.000 proteiner fra dyrkede celler kan identificeres i en &quot;single shot&quot; 4 timer LC-MS/MS analyse 7. Men denne type analyse anvendes på indfødte væv sjældent tillader identifikation af mere end 3.000 tusind proteiner. For at øge af dybden af ​​analysen peptider genereres i MED FASP skal være præ-fraktioneret før LC-MS/MS. Mikro-kolonne separation sax baseret på, er en enkel og effektiv fraktionering metode 10. Det er allerede blevet anvendt i flere proteom undersøgelser, herunder dem, der analyserer fast væv 5, 8, 9. Sax-&#39;pipette-tip&#39; microcoluMNS, og C 18 - &#39;StageTip&#39; afsaltningen afdrypper kolonne 9 er nemme at tilberede. Søjlerne samles ved at stable stik, skåret fra SAX eller C 18-membraner i en 200 pi pipettespids 11. Eksempler på analysen af SAX-fraktioneret FFPE prøver er vist i tabel 1.. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figur 1. Procedure overblik. Proceduren består af fire forskellige dele: (1) Fremstilling af dele af FFPE prøver og dets mikrodissektion, (2) lysis af prøven og behandlingen af ​​de proteiner, der bruger MED FASP tilgang, og (3) kvantificering og (4) fraktionering af peptiderne. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Prøve </td><td fo:width="1in"> Prøve præ-fraktionering / fordøjelse </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Massespektrometer anvendes </td><td fo:width="1.25in"> Peptid udbytte ng / nL prøve (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Unikke Protein Identifikationer Per enkelt prøve </td><td fo:width=".75in"> Henvisning </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Normal kolonmucosa </td><td> SAX / et enzym </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5.985 ± 54 5.868 ± 110 </td><td> 8. </td></tr><tr><td> • adenom </td><td> SAX / to enzymer </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9.501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Repræsentative resultater af proteomikanalyser af FFPE Mikrodissekterede væv.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Archival formalin faste og paraffinindlejret (FFPE) kliniske prøver er værdifuldt materiale til undersøgelse af sygdomme. Her demonstrerer vi en prøveforberedelse workflow tillader indgående proteomisk analyse af mikrodissekeres FFPE væv.

Proteomiske Prøveforberedelse fra formalin Faste og Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering for formalin Faste nyrevæv

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR er en følsom og hurtig metode til påvisning af Cytomegaloviral DNA i formalin-faste, paraffinindstøbt biopsivæv

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Anvender digitale Droplet PCR til Detect BRAF V600E Mutationer i formalinfikserede paraffinindlejrede Reference Standard cellelinier

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Fremstilling af formalin-fikseret paraffinindlejret væv borekerner til både RNA og DNA ekstraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...