Name: proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00
Duration: 9 min 20 s
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L&#39;auteur remercie le Dr Matthias Mann pour le soutien continu et Mme Katharina Zettl pour démontrer la méthode. Ce travail a été soutenu par la Société Max-Planck pour l&#39;avancement des sciences.

Une. Instrumentation requis <ol><li> Préparation des tranches de tissu pour microdissection et échantillon lyse <ol><li> Thermoblock réglé sur 99 ° C ou un bain d&#39;eau bouillante. </li><li> Laser exploitation microdissecteur (par exemple PALM, Zeiss, Göttingen, Allemagne). </li><li> Thermostaté paillasse centrifugeuse, température réglée à 20 ° C. </li><li> Chambre humide (boîte) avec un support pour les tubes d&#39;évacuation de type Eppendorf. </li><li> Incubateur réglé à 37 ° C. </li><li> Spectrofluorometer permettant la mesure de la fluorescence excitée à proximité de la lumière UV avec des cuves en quartz micro-échelle (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Solutions <ol><li> «Tissue Lysis Buffer» (TLB): 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M de DTT, 0,5% (p / v) de polyethylene glycol 20 000 et 4% de SDS. </li><li> Solution UC: 8 M d&#39;urée dans 0,1 M de Tris-HCl pH 8,5. Préparer 1 ml par 1 échantillon. Solutions UC et de l&#39;AAI doivent être fraîchement préparées et utilisées dans une journée. </li><li> Solution IAA: 0,05 M iodoacetamide en UC. Préparer 0,1 ml par 1 échantillon. </li><li> Endoprotéinase Lys-C, la solution mère. </li><li> Trypsine, la solution mère. </li><li> «Tampon de digestion» (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Préparer 0,25 ml par 1 échantillon. </li><li> «Tryptophane Standard Solution &#39;: 0,1 ug tryptophane dans 1 ml d&#39;eau déminéralisée. </li><li> Assay tampon B &#39;(ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Solution mère de Britton &amp; Universal Buffer Robinson (brub). Préparer une solution contenant 0,1 M de CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, et 0,1 MH 3 BO 3 et ajuster avec NaOH 1 M à pH requis (2, 4, 5, 6, et 11). Avant utilisation diluer 5 fois avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Tampon A: 1% (v / v) de CH 3 COOH dans de l&#39;eau désionisée. </li><li> Tampon B: 60% (v / v) de CH 3 CN, 1% (v / v) de CH3COOH dans l&#39;eau désionisée. </li></ol> 3. Pipette Conseil et colonnes &quot;StageTip &#39; <ol><li> Préparer SAX pointe-colonne par empilement de 6 couches de membrane Empore-anion dans une common 0,2 ml pointe de la pipette. Faites deux colonnes SAX-pointe par exemple. </li><li> Préparez &#39;StageTip&#39; en empilant trois couches de Empore-C 18 dans une pipette de 0,2 ml. Faire 6 conseils de Scène pour chaque échantillon. </li></ol> 4. Préparation des tranches de tissu pour microdissection et d&#39;échantillons de lyse <ol><li> Des sections avec un microtome coupé (l&#39;épaisseur des tranches dépend de l&#39;échantillon. Habituellement microdissection fonctionne bien avec des tranches de 7-10 um). </li><li> Irradier les diapositives de la membrane (MembraneSlide 1.0 PEN) avec la lumière UV pendant 45 min. </li><li> Montez les sections sur les lames de la membrane irradier et sec à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Déparaffiner les sections montées par deux incubations successives dans le xylène pendant 2,5 minutes et 1,5 min. Réhydrater les sections par des incubations successives dans l&#39;éthanol absolu, 70% d&#39;éthanol et de l&#39;eau, chaque pendant 1 min. </li><li> Colorer les sections avec l&#39;hématoxyline de Mayer pendant 20 secondes, rincer à l&#39;eau pendant 1 min, et sécher à l&#39;air. </li><li> Recueillir les populati cellulairesd&#39;intérêt en utilisant le système de microdissection par capture laser. Lors de l&#39;utilisation de l&#39;instrument PALM (Zeiss) collecter les échantillons dans les bouchons adhésifs (adhésif PAC 200). </li><li> Pipeter une aliquote de la TLB sur le matériau microdisséquée dans le capuchon. Fermer le tube et recueillir la suspension par une courte centrifugation. Lyse la microdissection de tissu à 99 ° C dans un bloc chauffant avec agitation (600 rpm) pendant 1 heure. Utilisez 3 pi de tampon pour 10 nl du tissu microdissection. </li><li> Clarifier l&#39;extrait brut par centrifugation à 16 000 g à 18 ° C pendant 10 min. Le lysat peut être conservé congelé à -20 ° C. </li></ol> 5. Traitement des échantillons <ol><li> Mélangez jusqu&#39;à 50 pi de lysat clarifié avec 200 pi d&#39;UC dans les unités d&#39;ultrafiltration (30k légale) et centrifuger à 14 000 xg jusqu&#39;à moins de 10 pi de la solution resteront dans le filtre. Habituellement, cette étape nécessite 10-15 min centrifugation. </li><li> Introduire à la pipette 200 ul d&#39;UC à l&#39;unité d&#39;ultrafiltrationet centrifuger comme en 5.1. Vider le tube de collecte. </li><li> Pipette 50 ul de solution IAA et mélanger à 600 rpm dans un thermo-mélangeur pendant 1 min et centrifuger comme en 5.1. </li><li> Introduire à la pipette 100 ul d&#39;UC à l&#39;unité d&#39;ultrafiltration et centrifuger comme en 5.1. Répétez cette étape deux fois </li><li> Ajouter 100 pi de la DB à l&#39;unité d&#39;ultrafiltration et centrifuger à 5.1. Répétez cette étape deux fois. </li><li> Transférer les unités de filtration de nouveaux tubes de prélèvement. Introduire à la pipette 40 ul de DB avec l&#39;endoprotéinase Lys-C (protéinase par rapport au total de protéine de 1:100) et mélanger à 600 tpm dans thermo-malaxeur pendant 1 min. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 ° C pendant 18 heures. </li><li> Centrifuger les unités de filtration à 14 000 x g comme dans 5.1. </li><li> Introduire à la pipette 160 ul d&#39;eau désionisée et on centrifuge les unités de filtre comme dans 5.1. Le flux continu commun (5.7 et 5.8 étapes) contient les peptides libérés par endoprotéinase Lys C. </li><li> Transférer l&#39;unité d&#39;ultrafiltration à un nouveau tube de collecte. Ajouter 40 ulDB avec de la trypsine (rapport enzyme à protéine 1:100) et mélanger à 600 tpm dans thermo-malaxeur pendant 1 min. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 ° C pendant 4 heures. Répétez les étapes 5.7 et 5.8 pour recueillir les peptides tryptiques. </li></ol> 6. La quantification des peptides <ol><li> La mesure de la teneur en peptides dans les produits de digestion de protéines peut être réalisée dans un tampon dilué, parce que les résidus tryptophane sont bien accessibles au solvant. </li><li> Introduire à la pipette 0,2 ml d&#39;ABB dans la cuvette de quartz et d&#39;enregistrer le spectre d&#39;émission de «blanc». </li><li> Préparer la courbe d&#39;étalonnage en utilisant 0,1 ug étapes en ajoutant 1 ul aliquotes de TSS à la cuvette et doux mélange avec l&#39;ABB. </li><li> Nettoyer la cuvette. </li><li> Pipeter l&#39;échantillon et enregistrer le spectre (échantillon). </li><li> Calcul de la concentration de protéine et de peptide Etant donné que 0,1 ug tryptophane correspond à environ 9 pg de protéine (sur la base de la moyenne de 1,1% de la teneur en tryptophane dans des mélanges protéiques obtenus by lyser les cellules humaines) la teneur en protéines de l&#39;échantillon ou dans le peptide contenu dans le produit de digestion est égale à: <img alt="Equation 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> où F (Standard1) est la fluorescence de 0,1 ug norme tryptophane. La teneur en peptide permet de calculer le rendement de la procédure de digestion et fournit des informations essentielles pour le peptide suivant le fractionnement et l&#39;analyse par spectrométrie de masse. </li></ol> 7. Fractionnement des Lys-C et tryptiques peptides <ol><li> Diluer les solutions de peptides obtenus par digestion avec Lys-C et de la trypsine avec 0,2 ml de brub pH 11 et pH 5, respectivement. </li><li> Monter la pointe SAX-colonne dans la centrifuge couvercle de l&#39;adaptateur de tube. </li><li> Laver et équilibrer la colonne de bout-SAX successivement avec 0,1 ml de methanol, 0,1 ml de NaOH 1 M, et trois fois avec 0,1 ml de brub, pH 11 pour la séparation de Lys-C Peptides et brub, pH 5 pour les peptides tryptiques. L&#39;écoulement des solutions à travers la matière de la colonne est facilitée par centrifugation à 4000 x g. </li><li> Laver et équilibrer les C 18 - &#39;StageTips&#39; ensuite, avec 0,05 ml de methanol, puis avec 0,05 ml de tampon B et avec 0,05 ml de tampon A. Préparer six C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 pour la séparation de la Lys- C peptides et deux pour la séparation des peptides trypsiques. </li><li> Assemblez le Tip-colonne SAX dans le C 18 - &#39;StageTip. Chargez les solutions d&#39;échantillon dans les SAX Tip-colonnes équilibrées et centrifuger les colonnes à 5000 g pendant 3 min. </li><li> Equilibrer les colonnes «pipette à pointe» avec 0,1 ml de la brub, pH 11 ou pH 5, respectivement à la Lyc-C et des échantillons tryptiques. Faciliter la circulation par centrifugation à 5000 x g. </li><li> Transférer le Tip-colonne SAX pour le prochain C 18 - &#39;StageTip. </li><li> Continuer l&#39;élution des peptides avec brub pH 6, 4 et 2 pour l&#39;échantillon C et avec Lys BRUB pH 2 pour l&#39;échantillon avec des peptides tryptiques. Pour chaque étape d&#39;élution utiliser un C séparé 18 - &#39;StageTip. </li><li> Laver les C 18 - «StageTips» avec 0,05 ml de tampon A. </li><li> Éluer des fractions de 0,05 ml de tampon B dans des flacons utilisés directement pour l&#39;injection des échantillons dans le système de LC assemblés avec un spectromètre de masse. </li></ol>

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	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

L&#39;auteur n&#39;a rien à révéler.

La possibilité d&#39;étudier la matière FFPE par la technologie protéomique à une profondeur comparable à séquençage des acides nucléiques et des techniques de puces à ADN ouvre de nouvelles perspectives dans les biomarqueurs et la découverte de cibles de médicament. Le protocole décrit permet la caractérisation et la quantification des protéomes des populations de cellules par microdissection sur une échelle de 10 000 protéines. Lorsque vous utilisez moins de la matière microdisséqués un petits ensembles de données peuvent être générés, mais peut-être dans de nombreux cas, les personnes peuvent aussi fournir de précieuses données cliniques. Ainsi, soit les échantillons peuvent être analysés directement après la procédure MED-FASP ou peuvent être séparés en fractions moins. Depuis procédure de FASP est compatible avec tout type de protéase, d&#39;autres enzymes ou leur combinaison peuvent être utilisés à partir de digestions protéiques 6. La qualité de la matière FFPE semble être le problème le plus critique de l&#39;analyse. Nous avons fait l&#39;expérience que le tissu fixé de la même origine, mais provenant de différentscliniques de rentes ont des propriétés distinctes. En utilisant des tissus provenant d&#39;une source, nous avons pu générer des peptides à des rendements élevés, tandis que d&#39;un autre matériau similaire clinique était presque inutile. Il est probable que la fixation et appliqué les procédures d&#39;enrobage ainsi que les conditions de stockage sont les principaux facteurs qui influent sur ​​les propriétés du matériau clinique 12. Par conséquent, il est conseillé de tester les propriétés de quelques échantillons avant de commencer un projet plus vaste. De nombreuses publications ont signalé l&#39;utilisation de la matière de FFPE dans le passé. Cependant, le nombre de protéines identifiées dans ces études n&#39;a jamais dépassé plus de protéines 1000-2000 4. Compte tenu de la taille des protéomes spécifiques de cellules humaines comprenant plus de 10 000 protéines, ces études ont pu seulement de fournir une image très superficielle, presque limité à des protéines hautement abondantes impliquées dans les fonctions d&#39;entretien ménager. Notre protocole permet l&#39;isolement efficace du matériel clinique ou biologique from conservé tissu et est optimisé pour la lyse, la transformation des protéines et des peptides préfractionnement. En conséquence notre échantillon préparation flux de travail, lorsqu&#39;il est couplé à la spectrométrie de masse haut de gamme, permet un aperçu des protéomes presque complets. Notable, cela est possible à des exigences minute montant de l&#39;échantillon. L&#39;avantage majeur de l&#39;utilisation des tissus conservés est leur large disponibilité relative. Échantillons FFPE archivés pendant de nombreuses années et des décennies, et parfois considérés comme inutiles, maintenant, grâce à la technologie protéomique, apparaissent comme matériau de grande valeur pour la recherche clinique. Alors que de nombreuses maladies peuvent être étudiés en utilisant l&#39;enquête de matière fraîche ou congelée de matériel FFPE semble être particulièrement important pour l&#39;étude des maladies rares 12, étaient collecte d&#39;un ensemble représentatif de l&#39;échantillon prend généralement beaucoup de temps.

Fixation au paraformaldéhyde et l&#39;intégration dans la paraffine (FFPE) est la méthode standard pour la conservation et l&#39;enquête pathomorphologiques de matériel tissulaire clinique. Microscopie du tissu conservé permet l&#39;identification des maladies liées à des changements morphologiques, et la détection et la notation de l&#39;apparition de maladies liées à des antigènes. Etant donné que généralement seule une petite partie de l&#39;échantillon FFPE est utilisé dans ces analyses, de grandes quantités de matériel clinique restent archivés et peuvent être exploitées dans d&#39;autres types d&#39;études. Au cours de la dernière décennie de la recherche en sciences de la vie a été renforcé par la technologie protéomique puissant. Cette technologie permet l&#39;identification et la quantification de milliers de protéines dans des mélanges complexes de protéines. Une caractéristique importante de cette technologie est que seulement des quantités infimes de matière sont nécessaires pour des analyses à grande échelle. Études protéomiques récentes ont démontré que les protéines peuvent être étudiés sur une échelle de un échantillon de près deLete Protéomes 1, 2. Ce type de système permet d&#39;investigations larges perspectives dans la composition des cellules et l&#39;identification des groupes de protéines qui se produisent à des niveaux anormaux de maladies. Considérant que ces études doivent grandes capacités de spectrométrie de masse, le travail récent a montré que dans la même mesure de l&#39;identification peut être réalisée en une seule journée de mesure 3. L&#39;exigence de la quantité d&#39;échantillon relativement faible et la grande disponibilité des échantillons cliniques et d&#39;autres conservés nous tentés de développer des méthodes permettant l&#39;exploration protéomique de la matière de la FFPE (pour une revue voir 4). Profitant de la réversibilité de la fixation au formol sous un traitement thermique, nous avons mis au point un protocole permettant l&#39;extraction quantitative des protéines à partir du tissu fixe 5. Nous avons montré que la procédure de fixation conserve pas seulement des protéines, mais aussi au moins certaines modifications post-traductionnelles. Phosphorylation et de N-glycosylation peuvent être étudiés en utilisant les échantillons FFPE 5, cependant une condition préalable pour cela est une des conditions de collecte de tissus, de stockage et de fixation contrôlés soigneusement. Ensuite, nous avons optimisé la méthode de microdissection par capture laser de tissu fixe et pour le réacteur en fonction protéomique traitement des échantillons 6, 7. Une étude à grande échelle sur le cancer colorectal a permis une analyse quantitative des protéines à partir de 7500 par microdissection de matériel clinique 8. Enfin, nous avons amélioré la façon de l&#39;exploration de la matière microdissection par l&#39;application consécutive de deux protéines de l&#39;étape protocole de digestion 9. En comparaison avec les stratégies de digestion communes utilisant enzyme unique, cette procédure permet la génération de plusieurs peptides de séquence unique et, par conséquent, se traduit par une plus grande profondeur de l&#39;identification des protéines. Analyse de microdissection adénome colique humaine a permis l&#39;analyse protéomique à une profondeur de 9500 protéines par exemple 3. Dans ce goujony nous avons cartographié 55 000 peptides par échantillon permettant l&#39;identification de 88-89% de protéines d&#39;au moins 2 peptides. Ici, nous présentons un protocole optimisé pour la préparation d&#39;échantillons à partir du matériau pour l&#39;analyse LC-MS/MS FFPE. Ce protocole comprend la préparation de coupes de tissu pour microdissection, la lyse des cellules isolées, et le traitement des échantillons dans un format de réacteur (FASP) 6. Ensuite, nous décrivons une détermination spectrofluorométrique des rendements peptidiques; une tâche avec une grande importance pour l&#39;identification de peptides optimale par la spectrométrie de masse. Enfin, nous démontrons un échangeur fort d&#39;anions (SAX) à base de technique de séparation pour le peptide fractionnement. Dans ce procédé, à la fois la séparation du peptide et le nettoyage final sont effectués en utilisant une pipette à pointe micro-colonnes 10, 11. Cette étape est facultative mais recommandée dans les études où plus de quelques microgrammes peptides peuvent être obtenus à partir d&#39;un seul échantillon. Le SAX-fractionnement peut augmenter considérablement le nombre et la gamme dynamique de identfications et étendre la couverture de la séquence de protéine 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Matériel clinique préservé est une source unique pour la recherche protéomique des maladies humaines. Ici, nous décrivons un protocole optimisé permettant l&#39;analyse quantitative à grande échelle de formol et inclus en paraffine fixé (FFPE) tissus. Le procédé comprend quatre étapes distinctes. Le premier est la préparation d&#39;articles à partir du matériau de FFPE et microdissection de cellules d&#39;intérêt. Dans la deuxième étape, les cellules isolées sont lysées et traitées à l&#39;aide &#39;filtre assistée préparation des échantillons&#39; (FASP) technique. Dans cette étape, les protéines sont épuisées à partir de réactifs utilisés pour la lyse de l&#39;échantillon et sont digérés en deux étapes à l&#39;aide de l&#39;endoprotéinase LysC et trypsine. Après chaque digestion, les peptides sont recueillis dans des fractions séparées et leur contenu est déterminée en utilisant une mesure de fluorescence très sensible. Enfin, les peptides sont fractionnés sur microcolonnes «pipette à pointe». Les LysC-peptides sont séparés en 4 fractions alors que la pe tryptiqueptides sont séparés en deux fractions. De cette manière, les échantillons préparés permettent l&#39;analyse des protéomes de quantités infimes de matière à une profondeur de 10 000 protéines. Ainsi, le flux de travail décrit est une technique puissante pour étudier les maladies dans un système à l&#39;échelle de la mode ainsi que pour l&#39;identification de biomarqueurs potentiels et de cibles thérapeutiques.

L&#39;analyse protéomique de matériel FFPE nécessite des méthodes robustes et reproductibles pour la préparation des échantillons. Dans cette publication, nous démontrons un protocole qui permet une isolation efficace des populations de cellules à partir de la matière fixée et de leur traitement chimique résultant en des fractions peptidiques de haute pureté qui peuvent être directement utilisées pour l&#39;analyse LC-MS/MS. La procédure se composent de quatre parties distinctes: (1) préparation de sections des échantillons FFPE et son microdissection, (2) la lyse de l&#39;échantillon et la transformation des protéines en utilisant l&#39;approche MED FASP, et (3) la quantification et (4) de fractionnement les peptides (figure 1). Dans la première étape de la procédure, les échantillons FFPE sont coupés avec un microtome et montées sur des lames de la membrane recouverte. Pour augmenter l&#39;adhérence entre les sections de tissu et la surface de la membrane de coulissement est nécessaire d&#39;irradier la surface de glissement avec une lumière UV. A cet effet, on utilise la lumière d&#39;une lampe UVintégré dans un banc de culture cellulaire. Après cette étape, les lames sont soumises à des lavages permettent l&#39;élimination de la paraffine et de réhydratation des échantillons. Le matériau réhydraté est coloré avec l&#39;hématoxyline pendant une courte période. Il en résulte une faible coloration de l&#39;échantillon, mais est suffisant pour la visualisation des zones de l&#39;échantillon pour microdissection. Le procédé de coloration doit être arrêtée rapidement par rinçage des lames avec un excès d&#39;eau. Une coloration prolongée des résultats de l&#39;échantillon des rendements peptidiques pauvres. Dans l&#39;étape suivante, les sections séchées sont soumises à une microdissection. La sélection des zones de tissu de cellules individuelles dépend du type d&#39;enquête et nécessite toujours une connaissance spécifique en histologie ou pathomorphologie. Le matériau laser-libéré est recueilli sur des surfaces adhésives des tubes de prélèvement d&#39;échantillon. Etant donné que la capacité de liaison de la matière adhésive est limitée, il est nécessaire de transférer la matière à partir de la microdissection couvercle à til tube après dissection de chaque 5.3 mm 2 de l&#39;échantillon. Ceci peut être facilement réalisé par pipetage de quelques microlitres de tampon de lyse tissulaire (LTB) sur le couvercle et une courte rotation du tube dans une centrifugeuse. Après que l&#39;échantillon est recueilli dans le fond du tube, la microdissection et le prélèvement de l&#39;échantillon sur le couvercle peuvent être poursuivies. Une fois que la totalité de l&#39;échantillon est collecté les tubes doivent être en plus bouché avec du Parafilm et on les incube dans un bain d&#39;eau à environ 99 ° C avec une agitation continue pendant 1 h. Etant donné que pendant l&#39;incubation de l&#39;eau se condense sur le couvercle, toutes les 15 min les tubes doivent être centrifugés brièvement pour collecter l&#39;eau de retour dans le cône de tube. Pour obtenir des peptides les lysats de tissus sont traités à l&#39;aide de l&#39;approche MED-FASP. Dans ce procédé, les protéines sont épuisées lysées du détergent et d&#39;autres substances de faible poids moléculaire, à carboamidomethylated résidus cystéinyle, puis consécutivement digérés par deux enzymes difféfrances à leurs spécificités de clivage: endoprotéinase LysC et la trypsine. Après chaque étape de digestion des peptides sont recueillis en fractions séparées. Dans cette partie de la préparation des échantillons, il est important de continuer à chacune des étapes de centrifugation jusqu&#39;à ce que plus de 95% de la solution initialement chargé dans l&#39;unité de filtration passé la membrane. L&#39;analyse de tissu de côlon et le cancer de sa nous avons observé que cette procédure rendements 3-6 pg de peptide pour 100 nl (tissu de 100 ug ou 10 mm 2 d&#39;une section de 10 um) de la matière microdisséquée (tableau 1). Étant donné que la protéine totale extraite de tissus est d&#39;environ 10% du poids du tissu les procédures d&#39;extraction et de digestion résultent ensemble dans un rendement de 30 à 60% dans le rapport à l&#39;origine du tissu frais. Ces valeurs reflètent les pertes de la protéine au cours de la déshydratation et de la coloration, microdissection, et la rétention de la partie de l&#39;échantillon non digéré dans les unités d&#39;ultrafiltration. Parce que l&#39;extraction et le traitement de pastissu FFPE n-microdisséquée résulté en un rendement de 5 75%, il est probable que les pertes d&#39;échantillons critiques se produisent au cours des étapes avant MED-FASP protéine-peptide-à-conversion. Une caractéristique importante des mélanges de peptides obtenus par cette procédure est leur grande pureté qui facilite en outre le processus de fractionnement des peptides de fractionnement et l&#39;identification par spectrométrie de masse. Ceci a été montré récemment, par une analyse des échantillons de l&#39;adénome colorectal 3. Dans cette étude, 40% des événements de MS / MS a conduit à l&#39;identification de peptides de tissu FFPE et a abouti à la cartographie d&#39;un maximum de 17 000 peptides seul passage par LC-MS/MS. Taux d&#39;identification plus élevés ont été atteints que dans l&#39;analyse de cellules congelées in vitro en culture 3. Dans les deux dernières parties de l&#39;ensemble de la procédure les peptides isolés sont quantifiés et fractionné sur microcolonnes pipette à pointe. Depuis les quantités de peptide isolé du tissu microdisséqués sont êtrebas 10 ug ils ne peuvent être quantifiés en utilisant des analyses de protéines couramment utilisées à base de colorants. De plus, les A 280 mesures spectrale UV à ces concentrations ne sont pas utiles en raison de l&#39;effet de diffusion de la lumière. En revanche, les mesures de fluorescence des résidus tryptophane offrent un moyen fiable pour la détermination de la teneur en peptide. Récemment, nous avons montré que jusqu&#39;à 5000 protéines à partir de cellules cultivées peuvent être identifiés dans un &quot;seul coup&quot; 4 d&#39;analyse h LC-MS/MS 7. Toutefois, ce type d&#39;analyse appliquée aux tissus natifs permet rarement l&#39;identification de plus de 3.000 milliers de protéines. Pour augmenter la profondeur de l&#39;analyse des peptides générés dans MED FASP doivent être pré-fractionné avant LC-MS/MS. Le micro-colonne de séparation SAX base est une méthode simple et efficace de fractionnement 10. Il a déjà été utilisée dans plusieurs études protéomiques y compris ceux analyser tissu fixe 5, 8, 9. Le SAX-microcolu «pipette à pointe &#39;mns, et le C 18 - dessalage colonnes &#39;StageTip&#39; 9 sont faciles à préparer. Les colonnes sont assemblées par empilement de bouchons, coupés de la SAX ou C 18 membranes, dans une pointe de pipette 200 pl 11. Des exemples de l&#39;analyse des échantillons FFPE SAX fractionnée sont présentés dans le tableau 1. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la procédure. La procédure se composent de quatre parties distinctes: (1) préparation de sections des échantillons FFPE et son microdissection, (2) la lyse de l&#39;échantillon et la transformation des protéines en utilisant l&#39;approche MED FASP, et (3) la quantification et (4) le fractionnement de les peptides. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Échantillon </td><td fo:width="1in"> Échantillon de pré-fractionnement / digestion </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Spectromètre de masse utilisé </td><td fo:width="1.25in"> rendement de peptides ng / échantillon nL (± écart-type) </td><td fo:width="1.25in"> Identifications de protéines uniques par échantillon unique </td><td fo:width=".75in"> Référence </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • muqueuse colique normale </td><td> SAX / une enzyme </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • colique adénome </td><td> SAX / deux enzymes </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Des résultats représentatifs des analyses protéomiques du tissu microdisséqués FFPE.

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