Name: proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00
Duration: 9 min 20 s
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Der Autor dankt Dr. Matthias Mann für die kontinuierliche Unterstützung und Frau Katharina Zettl zur Demonstration der Methode. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften unterstützt.

1. Besetzung Pflicht <ol><li> Herstellung von Gewebeschnitten für die Mikrodissektion und Proben Lyse <ol><li> Thermoblock auf 99 ° C oder ein Bad mit kochendem Wasser gesetzt. </li><li> Laser Betriebs Microdissector (zB PALM, Zeiss, Göttingen, Deutschland). </li><li> Temperiert Tischzentrifuge, Temperatur auf 20 ° C eingestellt </li><li> Wet Kammer (Box) mit einem Rack für Eppendorf-Röhrchen Typ Verfügung. </li><li> Brutschrank auf 37 ° C eingestellt </li><li> Spectrofluorometer ermöglicht Messung der Fluoreszenz in der Nähe von UV-Licht angeregt mit Mikro-Skala Quarzküvetten (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Lösungen <ol><li> &quot;Tissue Lysis Buffer (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0,5% (w / v) Polyethylenglykol 20.000 und 4% SDS. </li><li> UA-Lösung: 8 M Harnstoff in 0,1 M Tris-HCl pH 8,5. Bereiten 1 ml pro 1 Probe. UA und IAA-Lösungen müssen frisch zubereitet und innerhalb eines Tages verwendet werden. </li><li> IAA-Lösung: 0.05 M iodoacetamide in UA. Bereiten Sie 0,1 ml pro 1 Probe. </li><li> Endoproteinase Lys-C-, Lager-Lösung. </li><li> Trypsin-Stammlösung. </li><li> &quot;Aufschlusspuffer &#39;(DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Bereiten 0,25 ml pro 1 Probe. </li><li> &quot;Tryptophan-Standardlösung &#39;: 0,1 ug Tryptophan in 1 ml VE-Wasser. </li><li> &quot;Assay Puffer B &#39;(ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Stammlösung von Britton &amp; Robinson Universal-Buffer (BRUB). Eine Lösung, die 0,1 M CH &amp;sub3; COOH, 0,1 MH 3 PO 4, und 0,1 MH 3 BO 3, und stellen mit 1 M NaOH auf den gewünschten pH-Wert (2, 4, 5, 6 und 11). Vor Gebrauch verdünnen 5-fach mit VE-Wasser. </li><li> Puffer A: 1% (v / v) CH 3 COOH in entionisiertem Wasser. </li><li> Puffer B: 60% (v / v) CH 3 CN, 1% (v / v) CH3COOH in entionisiertem Wasser. </li></ol> 3. Pipettenspitze und &#39;StageTip&#39; Spalten <ol><li> Bereiten Spitze SAX-Säule durch Stapeln 6 Lagen Empore-Anionen-Membran in einer Common 0,2 ml Pipettenspitze. Machen Sie zwei SAX-Spitze Spalten pro Probe. </li><li> Vorbereiten &quot;StageTip &#39;durch Stapeln 3 Schichten Empore-C 18 in einer 0,2 ml Pipettenspitze. Machen Stufe 6 Tipps für jede Probe. </li></ol> 4. Herstellung von Tissue-Scheiben für Microdissection Sample Lyse <ol><li> Zuschnitte mit einem Mikrotom (die Dicke der Schichten hängt von der Probe. Gewöhnlich Mikrodissektion funktioniert gut mit Scheiben von 7-10 &amp;mgr; m). </li><li> Bestrahlen Membran Objektträger (1,0 MembraneSlide PEN) mit UV-Licht für 45 min. </li><li> Montieren Sie die Abschnitte über die Membran bestrahlen Rutschen und trocken bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Entparaffinieren montiert Abschnitte durch zwei aufeinanderfolgende Inkubation in Xylol für 2,5 min und 1,5 min. Rehydrieren die Abschnitte durch aufeinanderfolgende Inkubationen in absolutem Ethanol, 70% Ethanol und Wasser für jeweils 1 min. </li><li> Färben der Schnitte mit Mayers Hämatoxylin für 20 Sekunden gründlich mit Wasser für 1 min, und an der Luft trocknen. </li><li> Sammeln Sie die Zelle populatiüber Interessen mit Laser-Mikrodissektion System. Bei Verwendung der PALM Instrument (Zeiss) sammeln die Proben in den Haftkappen (Adhesive CAP 200). </li><li> Pipette einen aliquoten Teil der TLB über die mikrodissezierten Material in der Kappe. Schließen Sie das Rohr und sammeln die Suspension durch eine kurze Zentrifugation. Lyse der microdissected Gewebe bei 99 ° C in einem Heizblock unter Rühren (600 Upm) für 1 Stunde. Verwenden Sie 3 ul Puffer für 10 nl der mikrodissezierten Gewebe. </li><li> Klärung des Rohextraktes durch Zentrifugation bei 16.000 × g bei 18 ° C für 10 min. Das Lysat kann eingefroren bei -20 ° C gelagert werden </li></ol> 5. Probenbearbeitung <ol><li> Mischen bis zu 50 &amp;mgr; l des geklärten Lysats mit 200 ul UA in den Ultrafiltrationseinheiten (Forensic 30k) und Zentrifugation bei 14.000 × g bis weniger als 10 &amp;mgr; l der Lösung in den Filter verbleiben. Normalerweise erfordert dieser Schritt 10-15 min Zentrifugieren. </li><li> Pipettieren Sie 200 ul UA auf der Ultrafiltrationseinheitund Zentrifuge nach 5.1. Leeren Sie den Sammelröhrchen. </li><li> Je 50 ul der IAA-Lösung und Mischen bei 600 Upm in einem Thermomischer für 1 min und Zentrifuge nach 5.1. </li><li> Je 100 ul der UA auf die Ultrafiltrationseinheit und Zentrifuge nach 5.1. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal </li><li> Je 100 ul der DB in der Ultrafiltrationseinheit und Zentrifuge bei 5.1. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Übertragen Sie die Filteranlagen, neue Sammelröhrchen. Pipette 40 ul DB mit Endoproteinase Lys-C (Proteinase zum Gesamtprotein-Verhältnis von 1:100) und mischen bei 600 rpm im Thermomixer für 1 min. Die Einheiten Inkubieren in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 18 Stunden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Filtereinheiten bei 14.000 xg wie in 5.1. </li><li> Pipette 160 ul entionisiertem Wasser und Zentrifuge die Filtereinheiten, wie in 5.1. Die gepoolte Flow-Through-(5.7 und 5.8 Schritte) enthält die Peptide durch Endoproteinase Lys C freigesetzt </li><li> Übertragen Sie die Ultrafiltrationseinheit zu einem neuen Sammelrohr. In 40 ulDB mit Trypsin (Enzym-Protein-Verhältnis 1:100) und mischen bei 600 rpm im Thermomixer für 1 min. Die Einheiten Inkubieren in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 4 Stunden. Wiederholen Sie die Schritte 5.7 und 5.8, die tryptischen Peptide zu sammeln. </li></ol> 6. Quantifizierung der Peptide <ol><li> Die Messung der Peptidgehalt in der Proteinverdaus in verdünnter Puffer durchgeführt werden, da die Tryptophan-Reste auch für das Lösungsmittel zugänglich sind. </li><li> Pipettieren Sie 0,2 ml ABB in die Quarz-Küvette und Aufzeichnung der Emissionsspektrum für &#39;blank&#39;. </li><li> Bereiten Eichkurve mit 0,1 ug Schritte durch Zugabe von 1 ul Aliquots von TSS in die Küvette und sanfte Mischung mit der ABB. </li><li> Reinigen Sie die Küvette. </li><li> Pipettieren Sie die Probe und das Spektrum (Probe). </li><li> Berechnung der Protein-und Peptidkonzentration Da Tryptophan entspricht 0,1 ug bis etwa 9 &amp;mgr; g Protein (bezogen auf die durchschnittliche 1,1% der Tryptophangehalt in b erhaltenen Proteingemischeny Lyse menschlicher Zellen) der Proteingehalt der in der Probe oder Peptidgehalt in dem Digest entspricht: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> wo F (Standard1) ist die Fluoreszenz von 0,1 ug Tryptophan-Standard. Der Peptidgehalt ermöglicht die Berechnung der Ausbeute der Aufschlussverfahren und liefert wichtige Informationen für die folgende Peptid-Fraktionierung und die massenspektrometrische Analyse. </li></ol> 7. Fraktionierung der Lys-C und tryptischen Peptide <ol><li> Verdünne die durch Aufschluss mit Lys-C und Trypsin mit 0,2 ml BRUB pH 11 und pH 5 jeweils erhaltenen Peptidlösungen. </li><li> Montieren Sie den SAX-Spitze Spalte in der Zentrifugenrohr-Adapter Deckel. </li><li> Waschen und equilibrieren die Spitze SAX-Säule nacheinander mit 0,1 ml Methanol, 0,1 ml 1 M NaOH und 3-mal mit 0,1 ml BRUB, pH 11 für die Trennung von Lys-C Peptiund des mit BRUB, pH 5 für die tryptischen Peptide. Die Strömung der Lösungen durch die Säule Material wird durch Zentrifugation bei 4000 x g erleichtert. </li><li> Waschen und equilibrieren die C 18 - &#39;StageTips&#39; anschließend mit 0,05 ml Methanol, dann mit 0,05 ml Puffer B mit 0,05 ml Puffer A Vorbereiten sechs C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 für die Trennung des Lys- C-Peptide und zwei zur Trennung der tryptischen Peptide. </li><li> Montieren Sie den SAX Tip-Spalte in der C 18 - &#39;StageTip. Laden Sie die Musterlösungen in die äquilibriert SAX Tip-Säulen und die Spalten Zentrifuge bei 5000 g für 3 min. </li><li> Äquilibrieren die &quot;Pipette-Spitze&quot;-Säulen mit 0,1 ml der BRUB, pH 11 oder pH-Wert 5, die jeweils mit dem Lyc-C und Trypsin-Proben. Erleichterung der Strömung durch Zentrifugation bei 5000 x g. </li><li> Übertragen Sie die SAX-Tip-Spalte in die nächste C 18 - &#39;StageTip. </li><li> Weiterhin Eluieren der Peptide mit BRUB pH 6, 4 und 2 des Lys C-Probe und BRUB pH 2 für die Probe mit tryptischen Peptide. Für jeden Schritt der Elution eine separate C 18 - &#39;StageTip. </li><li> &#39;StageTips &quot;mit 0,05 ml Puffer A. - die C-18 waschen </li><li> Eluatfraktionen mit 0,05 ml Puffer B in Ampullen zur Injektion direkt von den Proben in LC-Systems mit einem Massenspektrometer verwendet montiert. </li></ol>

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	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. 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R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

Der Autor hat nichts zu offenbaren.

Die Fähigkeit, die FFPE Material von der Proteom-Technologie bis zu einer Tiefe vergleichbar mit Nukleinsäure-Sequenzierung und Microarray-Techniken zu studieren eröffnet neue Perspektiven in der Biomarker-und Target-Entdeckung. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Charakterisierung und Quantifizierung des Proteoms von Populationen von Zellen microdissected auf einer Skala von 10.000 Proteinen. Bei der Verwendung von weniger der mikrodissezierten Material eine kleinere Datenmengen erzeugt werden können, aber vielleicht in vielen Fällen die können auch wertvolle klinische Daten. So können entweder die Proben direkt nach der MED-FASP Verfahren analysiert werden oder kann in weniger Fraktionen getrennt werden. Da FASP Verfahren ist mit jeder Art von Protease-kompatibel ist, können andere Enzyme oder deren Kombination aus Protein-Verdauungen 6 verwendet werden. Die Qualität des Materials FFPE scheint die kritische Ausgabe der Analyse sein. Wir haben die Erfahrung, dass die feste Gewebe des gleichen Ursprungs, aber aus unterschiedlichHNO-Kliniken hatten unterschiedliche Eigenschaften. Mit Gewebe aus einer Hand konnten wir Peptide in hohen Ausbeuten zu erzeugen, während ähnlichem Material aus einer anderen Klinik war fast nutzlos. Es ist wahrscheinlich, daß die angelegte Fixierung und Einbettung Verfahren sowie Lagerbedingungen sind die wichtigsten Faktoren, die die Eigenschaften des klinischen Materials 12. Daher ist es ratsam, die Eigenschaften von wenigen Proben vor dem Start eines größeren Projekts zu testen. Viele Veröffentlichungen über die Verwendung der FFPE Material in der Vergangenheit. Jedoch ist die Anzahl von Proteinen in diesen Studien identifizierten niemals überschritten mehr als 1,000-2,000 Proteine ​​4. In Anbetracht der Größe der menschlichen Zelle spezifische Proteome mit mehr als 10.000 Proteine ​​waren solche Untersuchungen nur in der Lage, eine sehr oberflächliche Bild, fast zu hoch vorkommenden Proteine ​​in der Hauswirtschaft beteiligten Funktionen beschränkt ist. Unser Protokoll ermöglicht eine effiziente Isolierung des klinischen oder biologischen Material from erhalten Gewebe und ist für die Lyse-, Protein-und Peptid-Verarbeitungs Vorfraktionierung optimiert. Als Folge unserer Workflow-Probenvorbereitung, wenn sie auf die High-End-Massenspektrometrie gekoppelt sind, ermöglicht Einblicke in eine fast vollständige Proteome. Bemerkenswert ist in Minute Probenmenge Anforderungen das möglich. Der große Vorteil der Verwendung der konservierten Geweben ist ihre relativ breite Verfügbarkeit. FFPE-Proben für viele Jahre und Jahrzehnte archiviert und manchmal als so nutzlos, jetzt, dank Proteomics-Technologie, erscheinen als sehr wertvolles Material für die klinische Forschung. Während viele Krankheiten können mit frischem oder gefrorenem Material Untersuchung FFPE Material untersucht werden scheint besonders wichtig für die Untersuchung seltener Krankheiten 12 zu sein, waren eine Sammlung von repräsentativen Satz von Probe dauert in der Regel eine lange Zeit.

Fixierung mit Para und Einbettung in Paraffin (FFPE) ist die Standardmethode für die Erhaltung und pathomorphologischen Untersuchung von klinischen Gewebematerial. Mikroskopie des konservierten Gewebes ermöglicht die Identifizierung der Krankheit verbundenen morphologische Veränderungen und die Detektion und Wertung des Auftretens der Krankheit verbundenen Antigenen. Da in der Regel nur ein kleiner Teil der Probe wird in FFPE diesen Analysen verwendet, große Mengen von klinischem Material bleiben archiviert und kann in anderen Typen von Untersuchungen genutzt werden. Während des letzten Jahrzehnts hat die Forschung in den Lebenswissenschaften wurde von der mächtigen Proteom-Technologie verstärkt. Diese Technologie ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von tausenden von Proteinen in komplexen Proteingemischen. Ein wichtiges Merkmal der Technologie ist, dass nur geringe Mengen an Material erforderlich sind, für die großtechnische Analysen. Jüngste Studien zeigten, dass Proteom-Proteine ​​können auf einer Skala von fast Layout untersucht werdenlete Proteome 1, 2. Untersuchungen dieser Art ermöglicht systemweite Einblicke in die Zusammensetzung der Zellen und zur Identifizierung von Gruppen von Proteinen bei anomalen Niveaus bei Erkrankungen auftritt. Diese Studien erforderlichen großen massenspektrometrischen Kapazitäten hat die jüngste Arbeit zeigte, dass ähnliche Ausdehnung Identifikation kann innerhalb eines Tages der Messung 3 erreicht werden. Das Erfordernis der relativ geringen Probenmenge und die breite Verfügbarkeit der erhaltenen klinischen Proben versucht, uns und anderen Methoden ermöglicht proteomische Erforschung der FFPE Material (für eine Übersicht siehe 4) zu entwickeln. Unter Ausnutzung der Reversibilität der Formalin-Fixierung unter einer Wärmebehandlung haben wir ein Protokoll, das quantitative Extraktion von Proteinen aus der fixierten Gewebe 5 entwickelt. Wir haben gezeigt, dass die Fixierung Verfahren schont nicht nur Proteine, sondern auch zumindest einige posttranslationale Modifikationen. Phosphorylation und N-Glykosylierung kann mit den FFPE-Proben 5, aber eine Voraussetzung dafür ist ein gut kontrolliertes Gewebe Erhebung, Speicherung und Fixierung Bedingungen untersucht werden. Als nächstes haben wir die Methode für die Laser Mikrodissektion der festen Gewebe und für die Proteom-Reaktor basierte Probenaufbereitung 6, 7 optimiert. Eine großangelegte Studie über Darmkrebs erlaubt die quantitative Analyse von 7.500 Proteinen aus aus klinischem Material 8 mikrodissektiert. Schließlich haben wir den Weg der Erforschung des mikrodissezierten Material, indem zwei aufeinander folgenden Schritt-Proteinverdauung Protokoll 9 verbessert. Im Vergleich zu den gemeinsamen Aufschluss Strategien durch einzelnes Enzym, ermöglicht dieses Verfahren Generation mehr Sequenzspezifische Peptide und damit zu einer höheren Tiefe der Proteinidentifikation. Analyse der mikrodissezierten menschlichen Dickdarm-Adenom erlaubt Proteomanalyse bis zu einer Tiefe von 9.500 Proteine ​​pro Probe 3. In diesem Gestütwir y abgebildet 55.000 Peptide pro Probe zur Identifizierung von 88-89% Proteine ​​mit mindestens 2 Peptiden. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Vorbereitung von Proben aus der FFPE Material für LC-MS/MS Analyse. Dieses Protokoll umfasst Herstellung von Gewebeschnitten zur Mikrodissektion Lysis der isolierten Zellen, und Probenverarbeitung in einem Reaktor Format (FASP) 6. Dann beschreiben wir eine spektrofluorometrischen Bestimmung der Peptidausbeuten; eine Aufgabe mit für optimale Peptididentifikation hohe Bedeutung, die die Massenspektrometrie. Schließlich zeigen wir einen starken Anionenaustauscher (SAX)-basierten Trenntechnik für Peptid-Fraktionierung. In diesem Verfahren sowohl die Peptidtrennung und endgültige Bereinigung werden mit Pipettenspitzen-Mikrosäulen 10, 11 durchgeführt. Dieser Schritt ist optional, wird jedoch in Untersuchungen, bei denen mehr als ein paar Mikrogramm Peptide können aus einer Probe erhalten werden empfohlen. Der SAX-Fraktionierung kann die Anzahl und die Dynamik von ident deutlich erhöhenkationen und verlängern die Proteinsequenzabdeckung 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Konservierte klinischen Materials ist eine einzigartige Quelle für die proteomische Untersuchung der menschlichen Erkrankungen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll, das in großem Maßstab quantitative Analyse von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe. Das Verfahren umfasst vier verschiedene Schritte. Die erste ist die Herstellung von Teilen aus dem FFPE Material und Mikrodissektion von Zellen von Interesse. Im zweiten Schritt werden die isolierten Zellen werden lysiert und bearbeitet mit &#39;Filter gestützten Probenvorbereitung &quot;(FASP)-Technik. In diesem Schritt werden Proteine ​​von Reagenzien für die Lyse der Probe verwendet verarmt und in zwei Schritten mit Endoproteinase LysC und Trypsin verdaut. Nach jeder Verdauung werden die Peptide in getrennten Fraktionen gesammelt und deren Inhalte unter Verwendung eines hochempfindlichen Fluoreszenzmessung bestimmt. Schließlich werden die Peptide auf &#39;Pipettenspitze &quot;Mikrosäulen fraktioniert. Die LysC-Peptide sind in 4 Fraktionen getrennt wohingegen die tryptischen peptides in 2 Fraktionen getrennt. Auf diese Weise hergestellten Proben die eine Analyse der Proteome von Minute Mengen von Material bis zu einer Tiefe von 10.000 Proteinen. Somit ist der beschriebene Workflow eine leistungsstarke Technik für die Untersuchung Krankheiten in einem System-Wide-Mode sowie für die Identifikation von potenziellen Biomarkern und Drug Targets.

Proteom-Analyse von FFPE Material erfordert robuste und reproduzierbare Methoden für die Probenvorbereitung. In dieser Veröffentlichung zeigen wir, ein Protokoll, eine effektive Isolierung von Zellpopulationen aus dem festen Material und ihre chemischen Verarbeitung, was zu hohen Reinheit Peptidfraktionen, die direkt für LC-MS/MS Analyse verwendet werden kann. Das Verfahren besteht aus vier Teilen: (1) Herstellung der Abschnitte der FFPE-Proben und deren Mikrodissektion, (2) Lyse der Probe und Verarbeitung der Proteine ​​unter Verwendung von MED FASP Ansatz, und (3) Quantifizierung und (4) Fraktionierung die Peptide (Abbildung 1). Im ersten Schritt des Verfahrens die FFPE-Proben werden mit einem Mikrotom geschnitten und auf Objektträger aufgebracht Membran bedeckt. Um die Adhäsion zwischen den Gewebeabschnitten und der Oberfläche des Schiebers Membran zu erhöhen, ist erforderlich, um die Gleitoberfläche mit UV-Licht zu bestrahlen. Zu diesem Zweck das Licht einer UV-Lampe verwenden wirin ein Zellkulturbank integriert. Nach diesem Schritt werden die Objektträger zu wäscht das Entfernen von Paraffin-und Rehydrierung der Proben unterzogen. Das Material wird mit rehydriert Hematoxilin für kurze Zeit gefärbt. Dies führt zu einer schwachen Färbung der Probe ist aber ausreichend für die Visualisierung der Probenräume für die Mikrodissektion. Die Färbung ist durch Spülen der Objektträger mit einem Überschuß an Wasser rasch gestoppt werden. Eine anhaltende Färbung der Probe führt zu einer schlechten Peptid Erträge. Im nächsten Schritt werden die getrockneten Abschnitte sind Mikrodissektion unterzogen. Die Auswahl der Gewebebereiche einzelner Zellen hängt von der Art der Untersuchung und erfordert immer besondere Kenntnisse in der Histologie oder Pathomorphologie. Der Laser-Material-Freigabe auf Klebeflächen der Probensammelröhrchen gesammelt. Da die Bindungskapazität des Klebermaterials begrenzt ist es notwendig, die microdissected Material von dem Deckel zu übertragen ter Röhre nach der Sektion jeder 3-5 mm 2 der Probe. Dies kann leicht durch Pipettieren von wenigen Mikrolitern des Gewebes Lysepuffer (LTB) auf dem Deckel und einer kurzen Spinn des Rohres in einer Zentrifuge durchgeführt werden. Nachdem die Probe in dem Boden des Rohres gesammelt, kann die Mikrodissektion und der Probensammlung auf dem Deckel fortgesetzt. Nachdem die gesamte Probe wird gesammelt, um die Rohre zusätzlich mit Parafilm unter ständigem Rühren 1 Stunde mit einem Stopfen verschlossen und bei etwa 99 ° C in einem Wasserbad inkubiert. Da während der Inkubation Wasser kondensiert auf dem Deckel, alle 15 min die Rohre zu kurz zentrifugiert, um in der Röhre Kegel sammeln das Wasser zurück werden. Um die Peptide zu erhalten Gewebelysaten werden mit dem MED-FASP Ansatz verarbeitet. In diesem Verfahren werden die lysierten Proteine ​​werden aus dem Reinigungsmittel und anderen niedermolekularen Substanzen, an Cysteinresten carboamidomethylated erschöpft ist, und dann nacheinander mit zwei unter Enzymen verdautstörendes in ihrer Spaltung Besonderheiten: Endoproteinase LysC und Trypsin. Nach jedem Schritt der Verdauung werden die Peptide in getrennten Fraktionen gesammelt. In diesem Teil der Probenvorbereitung ist es wichtig, jeden der Zentrifugationsschritte, bis mehr als 95% der Lösung zunächst in die Filtrationseinheit geladen bestanden die Membran weiter. Analyse Kolon und ihre Krebs beobachteten wir, dass dieses Verfahren Ausbeuten 3-6 ug Peptid pro 100 nl (100 &amp;mgr; g Gewebe oder 10 mm 2 von einer 10 &amp;mgr; m-Bereich) des microdissected Materials (Tabelle 1). Da die extrahierbaren Gesamtprotein aus Gewebe etwa 10% der Gewebegewicht die Extraktions-und Aufschlussverfahren zusammen in einer 30-60% Ausbeute in Bezug auf die ursprüngliche Frischgewebe führen. Diese Werte beziehen sich auf Verluste des Proteins während der Dehydratisierung und der Färbung Mikrodissektion und Speicherung des Abschnitts der unverdaute Probe in der Ultrafiltrationseinheiten. Da Gewinnung und Verarbeitung von nichtn-microdissected FFPE Gewebe ergab Protein-zu-Peptid-Umwandlungsausbeute von 75% und 5 ist es wahrscheinlich, dass während der Schritte vor dem MED-FASP die kritischen Probenverluste auftreten. Ein wichtiges Merkmal der dabei erhaltenen Peptidgemische ist ihre hohe Reinheit, die weitere Fraktionierung Peptid-Fraktionierung Prozess und die Massenspektrometrie Identifizierung erleichtert. Dies wurde kürzlich durch eine Analyse von kolorektalem Adenom Proben 3 gezeigt. In dieser Studie über 40% der MS / MS-Ereignisse führten zu Identifizierung von Peptiden aus der FFPE Gewebe und führte zu Abbildung von bis zu 17.000 Peptide pro Einzellauf LC-MS/MS. Höhere Erkennungsraten sind nur in der Analyse von eingefrorenen in vitro kultivierten Zellen 3 erreicht. In den beiden letzten Teile des gesamten Verfahrens die isolierten Peptide quantifiziert und fraktionierte auf Pipettenspitze Mikrosäulen. Da die Peptidmengen aus dem Gewebe isoliert sind mikrodissezierten seinNieder 10 ug sie können nicht mit häufig verwendeten Farbstoff-Protein-Assays quantifiziert werden. Auch die A 280 UV-Spektral-Messungen bei diesen Konzentrationen nicht nützlich sind aufgrund der Lichtstreuungseffekt. Im Gegensatz Messungen der Fluoreszenz der Tryptophan bieten eine zuverlässige Methode für die Bestimmung der Peptidgehalt. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass bis zu 5.000 Proteine ​​aus kultivierten Zellen können in einem &quot;single shot&quot; 4 Stunden LC-MS/MS Analyse 7 identifiziert werden. Doch diese Art der Analyse zu nativen Geweben angewandt selten erlaubt die Identifizierung von mehr als 3.000 Tausend Proteinen. Um die Tiefe der Analyse in die MED FASP erzeugten Peptide vor, fraktioniert werden, bevor LC-MS/MS haben, zu erhöhen. Das SAX basierend Mikrotrennsäule ist eine einfache und effiziente Fraktionierungsverfahren 10. Es wurde bereits in verschiedenen proteomischen Untersuchungen einschließlich der Analyse von fixierten Gewebe 5, 8, 9 aufgebracht ist. Der SAX-&quot;Pipette-Spitze&quot; microcolumns, und der C 18 - &#39;StageTip&#39; Entsalzungssäulen 9 sind einfach zuzubereiten. Die Spalten werden durch Stapeln der Stecker zusammengebaut ist, von dem SAX geschnitten oder C 18-Membranen in einem 200 &amp;mgr; l-Pipettenspitze 11. Beispiele für die Analyse der SAX-fraktioniert FFPE-Proben sind in Tabelle 1 gezeigt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Übersicht über die Verfahren. Das Verfahren besteht aus vier Teilen: (1) Herstellung der Abschnitte der FFPE-Proben und deren Mikrodissektion, (2) Lyse der Probe und Verarbeitung der Proteine ​​unter Verwendung von MED FASP Ansatz, und (3) Quantifizierung und (4) Fraktionierung die Peptide. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Probe </td><td fo:width="1in"> Beispiel Vorfraktionierung / Verdauung </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Massenspektrometer </td><td fo:width="1.25in"> Peptid-Ausbeute ng / nL Probe (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Einzigartige Protein Identifikationen pro Einzelprobe </td><td fo:width=".75in"> Referenz </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Normal Darmschleimhaut </td><td> SAX / ein Enzym </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • Dickdarm-Adenom </td><td> SAX / zwei Enzyme </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Repräsentative Ergebnisse der Proteom-Analysen der FFPE mikrodissezierten Gewebe.

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Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

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