Name: proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00
Duration: 9 min 20 s
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L&#39;autore ringrazia il Dott. Matthias Mann per il continuo supporto e la signora Katharina Zettl per dimostrare il metodo. Questo lavoro è stato supportato dal Max-Planck per l&#39;Avanzamento della Scienza.

1. Strumentazione necessaria <ol><li> Preparazione di fette di tessuto per microdissezione e il campione lisi <ol><li> Thermoblock impostato a 99 ° C o di una vasca da bagno con acqua bollente. </li><li> Laser microdissector operativo (ad esempio PALM, Zeiss, Göttingen, Germania). </li><li> Termostatato da banco centrifuga, la temperatura impostata a 20 ° C. </li><li> Camera umida (box) con un rack per tubi di smaltimento Eppendorf tipo. </li><li> Incubatore a 37 ° C. </li><li> Spettrofluorimetro consentendo di misurazione della fluorescenza eccitata vicino a luce UV con cuvette di quarzo micro-scala (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Soluzioni <ol><li> &#39;Tissue Lysis Buffer&#39; (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0.5% (w / v) di polietilenglicole 20.000 e 4% SDS. </li><li> Soluzione UA: 8 M urea in 0,1 M Tris-HCl pH 8.5. Preparare 1 ml per 1 campione. Le soluzioni UA e IAA devono essere preparate al momento e utilizzati entro un giorno. </li><li> Soluzione IAA: 0,05 M iodoacetamide in UA. Preparare 0.1 ml per 1 campione. </li><li> Endoproteinase Lys-C, soluzione stock. </li><li> Tripsina, soluzione stock. </li><li> &#39;Digestione del buffer&#39; (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8.5. Preparare 0,25 ml per 1 campione. </li><li> &#39;Triptofano Soluzione Standard&#39;: 0,1 mg di triptofano in 1 ml di acqua deionizzata. </li><li> &#39;Assay buffer di B&#39; (ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Soluzione madre di Britton &amp; Robinson Tampone universale (BRUB). Preparare una soluzione contenente 0,1 M CH 3 COOH, 0,1 MH 3 PO 4, e 0,1 MH 3 BO 3 e regolare con 1 M NaOH al pH desiderato (2, 4, 5, 6, e 11). Prima dell&#39;uso diluire 5 volte con acqua deionizzata. </li><li> Tampone A: 1% (v / v) CH 3 COOH in acqua deionizzata. </li><li> Tampone B: 60% (v / v) CH 3 CN, 1% (v / v) CH3COOH in acqua deionizzata. </li></ol> 3. Pipetta Tip e colonne &quot;StageTip &#39; <ol><li> Preparare SAX tip-colonna impilando 6 strati di membrana Empore-anioni in un common 0,2 ml punta della pipetta. Fare due colonne SAX-tip per campione. </li><li> Preparare &#39;StageTip&#39; impilando 3 strati di Empore-C 18 in un puntale di 0,2 ml. Effettuare 6 punte palco per ogni campione. </li></ol> 4. Preparazione di fette di tessuto per Microdissection e dei Campioni Lysis <ol><li> Tagliare sezioni con un microtomo (lo spessore delle fette dipende dal campione. Solitamente microdissezione funziona bene con le fette di 7-10 micron). </li><li> Irradiare diapositive membrana (MembraneSlide 1.0 PEN) con raggi UV per 45 min. </li><li> Montare le sezioni sui vetrini di membrana irradiare e asciutto, a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Sparaffinare e portare le sezioni montati da due incubazioni successive in xilene per 2,5 minuti e 1,5 min. Reidratare le sezioni da incubazioni consecutivi in ​​etanolo assoluto, etanolo al 70% e acqua, ciascuno per 1 min. </li><li> Macchiare le sezioni con ematossilina di Mayer per 20 secondi, sciacquare con acqua per 1 minuto, e aria secca. </li><li> Raccogliere le populati cellularisu interessi utilizzando il sistema di microdissezione laser capture. Quando si utilizza lo strumento PALM (Zeiss) raccogliere i campioni nei tappi adesivi (adesivi PAC 200). </li><li> Pipettare un&#39;aliquota del TLB sul materiale microdissezione nel tappo. Chiudere la provetta e raccogliere la sospensione con un breve centrifugazione. Lyse tessuto microdissezione a 99 ° C su una piastra riscaldante con agitazione (600 rpm) per 1 ora. Utilizzare 3 ml di tampone per 10 nl del tessuto microdissezione. </li><li> Chiarire l&#39;estratto grezzo mediante centrifugazione a 16.000 xg a 18 ° C per 10 min. Il lisato può essere conservati congelati a -20 ° C. </li></ol> 5. Elaborazione del campione <ol><li> Mescolare fino a 50 ml di lisato chiarificato con 200 ml di UA nelle unità di ultrafiltrazione (30k forense) e centrifugare a 14000 g fino a meno di 10 microlitri della soluzione rimarranno nel filtro. Di solito questo passo richiede 10-15 minuti centrifugazione. </li><li> Pipettare 200 ml di UA all&#39;unità di ultrafiltrazionee centrifugare come in 5.1. Svuotare il tubo di raccolta. </li><li> Pipettare 50 ml di soluzione di IAA e miscelare a 600 rpm in una termo-mixer per 1 min e centrifugare come in 5.1. </li><li> Aggiungere 100 ml di UA all&#39;unità di ultrafiltrazione e centrifugare come in 5.1. Ripetere questa operazione due volte </li><li> Dispensare 100 ml di DB all&#39;unità di ultrafiltrazione e centrifugare a 5.1. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Trasferire le unità di filtrazione a nuovi tubi di raccolta. Pipettare 40 microlitri DB con endoproteinase Lys-C (proteinasi rapporto proteine ​​totali di 1:100) e miscelare a 600 rpm in termo-mixer per 1 min. Incubare le unità in una camera umida a 37 ° C per 18 ore. </li><li> Centrifugare le unità filtranti a 14000 g come in 5.1. </li><li> Pipettare 160 ml di acqua deionizzata e centrifugare le unità filtranti come in 5.1. La flow-through pool (5.7 e 5.8 punti) contiene i peptidi rilasciati da endoproteinase Lys C. </li><li> Trasferire unità di ultrafiltrazione a un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 40 microlitriDB con tripsina (enzima proteina rapporto 1:100) e miscelare a 600 rpm in termo-mixer per 1 min. Incubare le unità in una camera umida a 37 ° C per 4 ore. Ripetere i punti 5.7 e 5.8 per raccogliere i peptidi triptici. </li></ol> 6. La quantificazione dei peptidi <ol><li> La misurazione del contenuto di peptide in digest proteina può essere eseguita in tampone diluito perché i residui di triptofano sono ben accessibile al solvente. </li><li> Pipettare 0,2 ml di ABB in cuvetta di quarzo e registrare lo spettro di emissione di &#39;vuoto&#39;. </li><li> Preparare curva di calibrazione utilizzando 0,1 mg passi con l&#39;aggiunta di 1 ml aliquote TSS alla cuvetta e delicato mix con la ABB. </li><li> Pulire la cuvetta. </li><li> Pipettare il campione e registrare lo spettro (campione). </li><li> Calcolo della concentrazione di proteine ​​e peptidi Da 0.1 mg triptofano corrisponde a circa 9 mg proteina (basata sulla media 1.1% del contenuto di triptofano in miscele proteiche ottenute by lisi cellule umane), il contenuto proteico della a contenuto campione o peptide nel digest è pari a: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> dove F (Standard1) è la fluorescenza di 0.1 mg standard di triptofano. Il contenuto peptide permette di calcolare la resa del procedimento digestione e fornisce informazioni essenziali per seguenti peptide frazionamento e spettrometria di massa. </li></ol> 7. Il frazionamento delle Lys-C e trittico peptidi <ol><li> Diluire le soluzioni di peptidi ottenuti dalla digestione con Lys-C e tripsina con 0,2 ml di BRUB pH 11 e pH 5, rispettivamente. </li><li> Montare la punta della colonna SAX nella centrifuga coperchio dell&#39;adattatore tubo. </li><li> Lavare ed equilibrare la punta-colonna SAX successivamente con 0,1 ml di metanolo, 0,1 ml di 1 M NaOH, e 3 volte con 0,1 ml di BRUB, pH 11 per la separazione di Lys-C Peptides e con BRUB, pH 5 per i peptidi triptici. Il flusso delle soluzioni mediante il materiale della colonna è facilitato mediante centrifugazione a 4000 x g. </li><li> Lavare ed equilibrare le C 18 - &#39;StageTips&#39; successivamente, con 0,05 ml di metanolo, poi con 0,05 ml di tampone B e con 0,05 ml di tampone A. Preparare sei C 18 - &#39;StageTips; 4 per la separazione del Lys- peptidi C e due per la separazione dei peptidi triptici. </li><li> Montare il SAX Tip-colonna della C 18 - &#39;StageTip&#39;. Caricare le soluzioni campione nelle SAX Tip colonne equilibrate e centrifugare le colonne a 5.000 xg per 3 min. </li><li> Equilibrare le colonne &quot;pipetta a punta&quot; con 0,1 ml di BRUB, pH 11 o pH 5, rispettivamente al Lyc-C e campioni triptici. Facilitare il flusso mediante centrifugazione a 5.000 x g. </li><li> Trasferire la Tip-colonna SAX alla prossima C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Continua eluizione dei peptidi con BRUB pH 6, 4 e 2 per il campione Lys C e con BRUB pH 2 per il campione con peptidi triptici. Per ogni fase di eluizione usare un C separato 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Lavare le C 18 - &#39;StageTips&#39; con 0,05 ml di tampone A. </li><li> Eluire frazioni con 0,05 ml di tampone B in fiale utilizzate direttamente per l&#39;iniezione dei campioni nel sistema LC assemblati con uno spettrometro di massa. </li></ol>

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	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

L&#39;autore non ha nulla da rivelare.

La possibilità di studiare il materiale FFPE dalla tecnologia proteomica ad una profondità comparabile con il sequenziamento degli acidi nucleici e delle tecniche di microarray apre nuove prospettive nella biomarker e la destinazione della droga scoperta. Il protocollo descritto ha la caratterizzazione e quantificazione di proteoma di popolazioni di cellule microdissezione su una scala da 10.000 proteine. Quando si utilizza meno del materiale microdissezione un set di dati più piccoli possono essere generati, ma forse in molti casi quelli può anche fornire dati clinici importanti. Così, sia i campioni possono essere analizzati direttamente dopo la procedura MED-FASP o possono essere separati in meno frazioni. Poiché procedura FASP è compatibile con qualsiasi tipo di proteasi, altri enzimi o la loro combinazione può essere utilizzato dalla digestione delle proteine ​​6. La qualità del materiale FFPE sembra essere il problema più critico dell&#39;analisi. Abbiamo sperimentato che il tessuto fissato della stessa origine ma provenienti da differisconocliniche ORL avevano proprietà distinte. Utilizzando il tessuto da una fonte siamo stati in grado di generare peptidi ad alti rendimenti, mentre materiale simile da un&#39;altra clinica era quasi inutile. E &#39;probabile che la fissazione applicata e procedure incorporamento nonché condizioni di conservazione sono i principali fattori che influenzano le proprietà del materiale clinico 12. Pertanto è consigliabile testare le proprietà di alcuni campioni prima di iniziare un progetto più ampio. Molte pubblicazioni hanno riportato l&#39;uso del materiale FFPE in passato. Tuttavia, il numero di proteine ​​identificate in questi studi non superare più di 1.000-2.000 proteine ​​4. Considerando le dimensioni delle proteoma specifici di cellule umane aventi più di 10.000 proteine, tali studi sono stati in grado solo di fornire un quadro molto superficiale, quasi limitato a proteine ​​altamente abbondanti coinvolte in funzioni di manutenzione. Il nostro protocollo permette l&#39;isolamento efficiente del clinico o biologico materiale from conservato tessuto ed è ottimizzata per lisi, trasformazione di proteine ​​e peptidi prefrazionamento. Di conseguenza il nostro flusso di lavoro di preparazione del campione, quando accoppiato al spettrometria di massa di fascia alta, permette intuizioni di un proteoma quasi completi. Notevole, questo è possibile a requisiti di quantità di campione minuti. Il principale vantaggio di utilizzare i tessuti conservati è la loro relativa ampia disponibilità. Campioni FFPE archiviati per molti anni e decenni, e talvolta considerati come inutile, ora, grazie alla tecnologia proteomica, appaiono come materiale di grande valore per la ricerca clinica. Considerando che molte malattie possono essere studiate usando fresche o congelate indagine materiale di materiale FFPE sembra essere particolarmente importante per lo studio delle malattie rare 12, erano raccolta di una serie rappresentativa di campioni di solito richiede molto tempo.

Fissaggio con paraformaldeide e l&#39;inclusione in paraffina (FFPE) è il metodo standard per la conservazione e ricerca pathomorphologic di materiale tessuto clinico. Microscopia del tessuto conservato permette l&#39;identificazione di malattie legate cambiamenti morfologici, e la rilevazione e il punteggio di insorgenza di malattie legate antigeni. Dal momento che in genere solo una piccola parte del campione FFPE viene utilizzato in queste analisi, grandi quantità di materiale clinico rimangano archiviati e possono essere sfruttati in altri tipi di studi. Durante la recente decennio della ricerca nelle scienze della vita è stata rafforzata dalla potente tecnologia proteomica. Questa tecnologia consente l&#39;identificazione e la quantificazione di migliaia di proteine ​​in miscele complesse di proteine. Una caratteristica importante della tecnologia è che solo piccole quantità di materiale sono necessari per analisi su vasta scala. Recenti studi di proteomica hanno dimostrato che le proteine ​​possono essere studiate su una scala di quasi compLete proteoma 1, 2. Questo tipo di sistema permette indagini ampie conoscenze nella composizione delle cellule e l&#39;identificazione dei gruppi di proteine ​​che si verificano a livelli anomali nelle malattie. Considerando che tali studi richieste grandi capacità di spettrometria di massa, il recente lavoro ha dimostrato che simili entità della identificazione può essere raggiunto entro un solo giorno di misura 3. Il requisito di importo relativamente basso del campione e l&#39;ampia disponibilità di campioni clinici conservati noi e gli altri tentati di sviluppare metodi che permettano l&#39;esplorazione proteomica del materiale FFPE (per una rassegna vedi 4). Sfruttando la reversibilità della fissazione in formalina in un trattamento termico abbiamo sviluppato un protocollo che permette l&#39;estrazione quantitativa delle proteine ​​dal tessuto fissa 5. Abbiamo dimostrato che la procedura di sintesi conserva non solo proteine, ma anche almeno alcune modifiche post-traduzionali. Fosforylation e N-glicosilazione possono essere studiate usando i campioni FFPE 5, tuttavia un prerequisito perché è una delle condizioni di incasso dei tessuti, di stoccaggio e di fissazione controllati accuratamente. Successivamente, abbiamo ottimizzato il metodo di cattura microdissezione laser del tessuto fissato e per la proteomica reattore basato campione di trasformazione 6, 7. Uno studio su larga scala su cancro colorettale ha permesso l&#39;analisi quantitativa di 7.500 proteine ​​da microdissezione da materiale clinico 8. Infine, abbiamo migliorato il modo di esplorazione del materiale microdissezione mediante l&#39;applicazione consecutiva-two protocollo digestione delle proteine ​​passaggio 9. Rispetto alle strategie di digestione comuni utilizzando singolo enzima, questa procedura permette la generazione di più peptidi di sequenza univoco e, di conseguenza, si traduce in una maggiore profondità di identificazione delle proteine. Analisi di microdissezione adenoma del colon umano ha permesso l&#39;analisi proteomica ad una profondità di 9.500 proteine ​​per campione 3. In questo stalloney abbiamo mappato 55.000 peptidi per campione permettono l&#39;identificazione di 88-89% di proteine ​​con almeno 2 peptidi. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per la preparazione di campioni dal materiale FFPE per l&#39;analisi LC-MS/MS. Questo protocollo comprende preparazione di fettine di tessuto per microdissezione, lisi delle cellule isolate, e trattamento del campione in un formato reattore (FASP) 6. Poi si descrive una determinazione spettrofluorimetrico delle rese peptide, un compito con grande importanza per l&#39;identificazione ottimale peptide dalla spettrometria di massa. Infine, abbiamo dimostrato una forte scambiatore anionico (SAX) a base di tecnica di separazione per il peptide frazionamento. In questo metodo sia la separazione peptide e la pulizia finale sono effettuate utilizzando microcolonne pipetta-ribaltamento 10, 11. Questo passaggio è facoltativo ma è raccomandato in studi in cui più di pochi microgrammi di peptidi possono essere ottenuti da un singolo campione. Il SAX-frazionamento in grado di aumentare notevolmente il numero e la gamma dinamica di identPrecisazioni ed estendere la copertura sequenza proteica 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Materiale clinico conservato è una fonte unica per l&#39;indagine proteomica delle patologie umane. Qui si descrive un protocollo ottimizzato che consente larga scala l&#39;analisi quantitativa dei fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) tessuti. La procedura comprende quattro fasi distinte. Il primo è la preparazione di sezioni dal materiale FFPE e microdissezione di cellule di interesse. Nella seconda fase le cellule isolate vengono lisate e trattati con &#39;filtro aided preparazione del campione&#39; (FASP) tecnica. In questa fase, le proteine ​​sono esaurite da reagenti utilizzati per la lisi del campione e vengono digeriti in due fasi usando endoproteinase lysC e tripsina. Dopo ogni digestione, i peptidi sono raccolti in frazioni separate e il loro contenuto viene determinato utilizzando una misurazione di fluorescenza altamente sensibile. Infine, i peptidi vengono frazionati su microcolonne &#39;pipetta a punta. I lysC-peptidi sono suddivise in 4 frazioni, mentre il pe tritticoptides sono separati in due frazioni. In questo modo i campioni preparati permettono di analizzare proteoma da piccole quantità di materiale ad una profondità di 10.000 proteine. Così, il flusso di lavoro descritto è una tecnica potente per studiare malattie in un livello di sistema-moda così come per l&#39;identificazione di potenziali biomarcatori e bersagli farmacologici.

Analisi proteomica di materiale FFPE richiede metodi affidabili e riproducibili per la preparazione del campione. In questa pubblicazione si dimostra un protocollo che permette un efficace isolamento di popolazioni cellulari dal materiale fisso e la loro trasformazione chimica con conseguente elevata purezza frazioni peptidiche che possono essere utilizzati direttamente per l&#39;analisi LC-MS/MS. La procedura consiste di quattro parti distinte: (1) preparazione delle sezioni dei campioni FFPE e la sua microdissezione, (2) lisi del campione e l&#39;elaborazione delle proteine ​​mediante approccio MED FASP, e (3) quantificazione e (4) di frazionamento i peptidi (Figura 1). Nella prima fase del procedimento campioni FFPE sono sezionati con un microtomo e montati su membrana rivestita diapositive. Per aumentare l&#39;adesione tra le sezioni di tessuto e la superficie della membrana diapositiva è necessario per irradiare la superficie del vetrino con luce UV. A questo scopo si usa la luce di una lampada UVintegrato in un banco di coltura cellulare. Dopo questa fase i vetrini sono sottoposti a lavaggi permettendo la rimozione di paraffina e reidratazione dei campioni. Il materiale reidratato è macchiato con ematossilina per un breve periodo. Ciò si traduce in una debole colorazione del campione ma è sufficiente per la visualizzazione delle aree campione per microdissezione. La colorazione deve essere interrotta rapidamente risciacquando dei vetrini con un eccesso di acqua. Una colorazione prolungato dei risultati del campione di scarsi rendimenti peptidici. Nella fase successiva le sezioni essiccati sono sottoposti a microdissezione. La selezione delle aree tissutali di cellule individuali dipende dal tipo di indagine e richiede sempre conoscenze specifiche in istologia o Pathomorphology. Il materiale rilasciato laser viene raccolto su superfici adesive delle provette per il prelievo del campione. Poiché la capacità di legame del materiale adesivo è limitato è necessario trasferire il materiale microdissezione dal coperchio di tegli tubo dopo la dissezione di ogni 3-5 mm 2 del campione. Questo può essere fatto facilmente pipettaggio di pochi microlitri di tampone di lisi tissutale (LTB) sul coperchio e una breve rotazione del tubo in una centrifuga. Dopo che il campione viene raccolto sul fondo della provetta, la microdissezione e la raccolta del campione sul coperchio può essere proseguita. Una volta che l&#39;intero campione viene raccolto i tubi devono essere ulteriormente tappo con parafilm e incubate in un bagno d&#39;acqua a circa 99 ° C con agitazione continua per 1 ora. Poiché durante l&#39;incubazione acqua condensa sul coperchio, ogni 15 min i tubi devono essere poco centrifugato per raccogliere di nuovo l&#39;acqua nel cono tubo. Per ottenere peptidi lisati tissutali vengono elaborati utilizzando l&#39;approccio MED-FASP. In questo metodo le proteine ​​lisati sono esaurite dal detersivo e altre sostanze a basso peso molecolare, carboamidomethylated a residui di cisteina, e poi consecutivamente digeriti con due enzimi DIFferenza nelle loro specificità scissione: endoproteinase lysC e tripsina. Dopo ogni fase di digestione i peptidi sono raccolti in frazioni separate. In questa parte della preparazione del campione è importante continuare a ciascuna delle fasi di centrifugazione fino a oltre il 95% della soluzione inizialmente caricata nell&#39;unità di filtrazione superato la membrana. Analizzando tessuto del colon e del suo cancro abbiamo osservato che questa procedura rendimenti 3-6 pg di peptide per 100 nl (tessuto 100 mg o 10 mm 2 di una sezione di 10 um) del materiale microdissezione (Tabella 1). Poiché la proteina totale estraibile da tessuti è di circa il 10% del peso del tessuto le procedure di estrazione e digestione, congiuntamente, una resa del 30-60% nel rispetto al tessuto fresco originario. Questi valori riflettono perdite della proteina durante la disidratazione e colorazione, microdissezione e ritenzione della porzione del campione non digerito nelle unità di ultrafiltrazione. Poiché l&#39;estrazione e la lavorazione di nontessuto FFPE n-microdissezione comportato proteina-to-peptide-conversione resa del 75% 5 è probabile che le perdite di esempio critiche si verificano durante i passi prima MED-FASP. Una caratteristica importante delle miscele di peptidi ottenuti con tale procedura è la loro elevata purezza che facilita ulteriormente processo di frazionamento peptide frazionamento e l&#39;identificazione spettrometria di massa. Questo è stato recentemente dimostrato da un&#39;analisi di campioni di adenoma colorettale 3. In tale studio circa il 40% degli eventi MS / MS ha portato alla identificazione di peptidi dal tessuto FFPE e portato nella mappatura di fino a 17.000 peptidi per singola analisi LC-MS/MS. I tassi più alti di identificazione sono stati raggiunti solo in analisi delle cellule congelate in vitro in coltura 3. Nelle ultime due parti della intera procedura i peptidi isolati sono quantificati e frazionato su microcolonne pipetta a punta. Poiché la quantità di peptide isolato dal tessuto microdissezione sono esserebassa 10 mg non possono essere quantificati con comunemente usati saggi proteici a base di coloranti. Anche gli A 280 misurazioni UV-spettrale a tali concentrazioni non sono utili a causa della luce effetto di dispersione. Al contrario, le misurazioni di fluorescenza dei residui di triptofano offrono un modo affidabile per la determinazione del contenuto di peptide. Recentemente abbiamo dimostrato che fino a 5.000 proteine ​​da cellule in coltura possono essere identificati in un &#39;colpo solo&#39; 4 ore di analisi LC-MS/MS 7. Tuttavia questo tipo di analisi applicata a tessuti nativi raramente consente l&#39;identificazione di oltre 3.000 mila proteine. Per aumentare la profondità dell&#39;analisi peptidi generati in MED FASP devono essere pre-frazionata prima LC-MS/MS. La separazione micro-colonna SAX base è un metodo semplice ed efficiente frazionamento 10. E &#39;già stato applicato in diversi studi di proteomica compresi quelli analizzando tessuto fissato 5, 8, 9. Il SAX-microcolu &#39;pipetta punta&#39;MNS, e la C 18 - colonne di dissalazione &#39;StageTip&#39; 9 sono facili da preparare. Le colonne sono assemblati impilando di tappi, tagliati dalla SAX o C 18 membrane, in una microlitri punta di pipetta 11 200. Esempi di analisi dei campioni FFPE SAX-frazionata sono mostrati nella Tabella 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica della procedura. La procedura consiste di quattro parti distinte: (1) preparazione delle sezioni dei campioni FFPE e la sua microdissezione, (2) lisi del campione e l&#39;elaborazione delle proteine ​​mediante approccio MED FASP, e (3) quantificazione e (4) di frazionamento i peptidi. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Campione </td><td fo:width="1in"> Esempio di pre-frazionamento / digestione </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Spettrometro di massa utilizzato </td><td fo:width="1.25in"> Resa Peptide ng campione / nL (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Proteine ​​Identificazioni univoco per ogni singolo campione </td><td fo:width=".75in"> Riferimento </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • mucosa colica normale </td><td> SAX / un enzima </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • colon Adenoma </td><td> SAX / due enzimi </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6.1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Rappresentante dei risultati delle analisi proteomica del tessuto microdissezione FFPE.

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Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

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