Name: proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Forfatteren takket Dr. Matthias Mann for kontinuerlig støtte og Mrs. Katharina Zettl for å demonstrere metoden. Dette arbeidet ble støttet av Max-Planck Society for Advancement of Science.

En. Instrumentering Påkrevd <ol><li> Utarbeidelse av vev skiver for microdissection og prøvelyse <ol><li> Thermo satt til 99 ° C eller et bad med kokende vann. </li><li> Laser drifts microdissector (for eksempel PALM, Zeiss, Göttingen, Tyskland). </li><li> Termostatert benk-top sentrifuge, temperatur satt til 20 ° C. </li><li> Våt kammer (boks) med en reol for Eppendorf-type avhending rør. </li><li> Inkubator innstilt på 37 ° C. </li><li> Spektrofluorometer muliggjør måling av fluorescens opphisset nær UV lys med mikro-skala kvarts kyvetter (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Solutions <ol><li> &#39;Tissue Lysis Buffer (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0,5% (w / v) polyetylenglykol 20000 og 4% SDS. </li><li> UA-løsning: 8 M urea i 0,1 M Tris-HCl pH 8,5. Forbered en ml per 1 prøve. UA og IAA løsninger må være forberedt fersk og brukes innen en dag. </li><li> IAA løsning: 0,05 M iodoacetamide i UA. Forbered 0,1 ml per 1 prøve. </li><li> Endoproteinase Lys-C, lagerløsning. </li><li> Trypsin, stamløsning. </li><li> &#39;Fordøyelse buffer&#39; (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Forbered 0,25 ml per 1 prøve. </li><li> &#39;Tryptofan Standard Solution&#39;: 0,1 mg tryptofan i en ml avionisert vann. </li><li> &#39;Assay buffer B&#39; (ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Stamløsning av Britton &amp; Robinson Universal Buffer (BRUB). Tilbered en oppløsning inneholdende 0,1 M CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, og 0,1 MH 3 BO 3 og justeres med 1M NaOH til den påkrevde pH-verdien (2, 4, 5, 6 og 11). Før bruk fortynnes fem ganger med avionisert vann. </li><li> Buffer A: 1% (v / v) CH 3 COOH i avionisert vann. </li><li> Buffer B: 60% (v / v) CH3CN, 1% (v / v) CH3COOH i avionisert vann. </li></ol> Tre. Pipettespissen og &#39;StageTip&#39; Kolonner <ol><li> Forbered SAX tip-kolonne ved å stable seks lag med Empore-Anion membran i en common 0,2 ml pipette tips. Lag to SAX-tip kolonner per prøve. </li><li> Forbered &#39;StageTip&#39; ved å stable tre lag med Empore-C 18 i en 0,2 ml pipette. Gjør 6 Stage tips for hver prøve. </li></ol> 4. Utarbeidelse av Tissue Slices for microdissection og Sample Lysis <ol><li> Snitt med en mikrotom (tykkelsen av skivene er avhengig av prøven. Vanligvis mikrodisseksjon fungerer godt med skiver av 7-10 mikrometer). </li><li> Strålebehandling membran sklier (MembraneSlide 1,0 PEN) med UV-lys for 45 min. </li><li> Monter delene på de strålebehandling membran sklier og tørr ved 37 ° C i 2 timer. </li><li> Deparaffinize de monterte seksjoner ved to påfølgende inkubasjoner i xylen for 2,5 min og 1,5 min. Rehydrere seksjoner ved påfølgende inkubasjoner i absolutt etanol, 70% etanol, og vann, hver på 1 min. </li><li> Flekken seksjoner med Mayer hematoxylin for 20 sek, skyll med vann i 1 min, og lufttørke. </li><li> Samle cellen befolkningenpå av interesse å bruke laser capture microdissection system. Når du bruker PALM instrument (Zeiss) samle prøvene i limet caps (Lim CAP 200). </li><li> Pipetter en delmengde av TLB over microdissected materiale i hetten. Lukke røret og samle suspensjonen ved en kort sentrifugering. Lyse den microdissected vev ved 99 ° C i en varmeblokk med omrøring (600 rpm) i 1 time. Bruk 3 mL buffer for 10 nl av microdissected vev. </li><li> Klarhet i den urene ekstrakt ved sentrifugering ved 16.000 xg ved 18 ° C i 10 min. Lysatet kan lagres frosset ved -20 ° C. </li></ol> 5. Sample Processing <ol><li> Bland opp til 50 ul av den klarede lysat med 200 ul UA i ultrafiltreringsenheter (Forensic 30k) og sentrifuger ved 14.000 xg til mindre enn 10 ul av oppløsningen vil forbli i filteret. Vanligvis er dette trinnet krever 10-15 min sentrifugering. </li><li> Pipetter 200 pl UA til ultrafiltreringsenhetenog sentrifuger som i 5.1. Tøm samling rør. </li><li> Pipetter 50 pl IAA løsning og bland ved 600 rpm i en termo-mikser i 1 min og sentrifuger som i 5.1. </li><li> Pipetter 100 mL av UA til ultrafiltreringsenheten og sentrifuger som i 5.1. Gjenta dette trinnet to ganger </li><li> Pipetter 100 pl av den DB til ultrafiltreringsenheten og sentrifuger ved 5.1. Gjenta dette trinnet to ganger. </li><li> Overfør filtrering enheter til nye samling rør. Pipetter 40 pl DB med endoproteinase Lys-C (proteinase til totalt protein-forhold 1:100) og blandes ved 600 rpm i termo-mikser i 1 min. Inkuber enhetene i en fuktig kammer ved 37 ° C i 18 timer. </li><li> Sentrifuger filterenhetene ved 14 000 xg som i 5.1. </li><li> Pipetter 160 ul avionisert vann og sentrifuger filterenhetene som i 5.1. Den oppsamlede gjennomstrømning (5,7 og 5,8 trinn) inneholder peptider utgitt av endoproteinase Lys C. </li><li> Overfør til ultrafiltreringsenheten til en ny samling rør. Legg 40 mLDB med trypsin (enzym til protein ratio 1:100), og bland på 600 rpm i termo-mikseren i 1 min. Inkuber enhetene i en fuktig kammer ved 37 ° C i 4 timer. Gjenta trinn 5.7 og 5.8 for å samle tryptic peptider. </li></ol> 6. Kvantitering av peptidene <ol><li> Målingen av peptid-innholdet i fordøyer protein kan utføres i fortynnet buffer fordi tryptofan rester er godt tilgjengelig for løsningsmidlet. </li><li> Pipetter 0,2 ml av ABB inn i kvartskuvette og registrere emisjonsspektrum for &#39;blank&#39;. </li><li> Forbered kalibreringskurve ved hjelp av 0,1 ug trinn ved å tilsette en ul alikvoter av TSS til kyvetten og forsiktig blanding med ABB. </li><li> Rengjør kyvetten. </li><li> Pipetter prøven og registrere spekteret (prøve). </li><li> Beregn av protein-og peptid-konsentrasjon Etter 0,1 ug tryptofan tilsvarer omtrent 9 ug protein (basert på gjennomsnittlig 1,1% av tryptofan innholdet i proteinblandinger fremstilt by lysering humane celler) proteininnholdet i i prøven eller peptid-innhold i digest tilsvarer: <img alt="Ligning 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> hvor F (Standard1) er fluorescens av 0,1 ug tryptofan standard. Den peptid-innhold tillater beregning av utbyttet av oppslutningsprosedyre og gir viktig informasjon for å følge peptid fraksjonering og massespektrometrisk analyse. </li></ol> 7. Fraksjonering av Lys-C og tryptiske peptider <ol><li> Fortynn peptid-løsninger fremstilt ved digereringer med Lys-C og trypsin med 0,2 ml BRUB pH 11 og pH 5, henholdsvis. </li><li> Monter SAX tip-kolonne i sentrifugal røradapter lokk. </li><li> Vask og stabilisere den SAX tip-kolonne suksessivt med 0,1 ml metanol, 0,1 ml 1 M NaOH, og 3 ganger med 0,1 ml av BRUB, pH 11 for separasjon av Lys-C peptides og med BRUB, pH 5 for de tryptic peptider. Strømmen av de løsningene materiale kolonnen gjennom lettes ved sentrifugering ved 4000 x g. </li><li> Vask og stabilisere de C 18 - &#39;StageTips&#39; deretter med 0,05 ml metanol, og deretter med 0,05 ml av buffer B med 0,05 ml av Buffer A. Forbered seks C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 for separasjon av Lys- C-peptider og to for separasjon av de tryptic peptider. </li><li> Monter SAX Tip-kolonne i C 18 - &#39;StageTip&#39;. Last inn eksempel løsninger inn i ekvilibrert SAX Tip-kolonner og sentrifuger kolonnene ved 5000 xg i 3 min. </li><li> Stabilisere de &quot;pipette-spissen kolonnene med 0,1 ml av den BRUB, pH 11 eller pH 5, henholdsvis til Lyc-C og tryptic prøver. Lette flyten ved sentrifugering ved 5000 x g. </li><li> Overfør SAX Tip-kolonne til den neste C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Fortsett elueringen av peptidene med BRUB pH 6, 4 og 2 for Lys C prøven og med BRUB pH 2 for prøven med tryptic peptider. For hver elueringstrinnet bruke en separat C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Vask C 18 - &#39;StageTips&#39; med 0,05 ml Buffer A. </li><li> Eluer fraksjoner med 0,05 ml av buffer B i ampuller som benyttes direkte til injeksjon av prøvene inn i LC-systemet sammenføyd med et massespektrometer. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

Forfatteren har ingenting å avsløre.

Muligheten til å studere FFPE materiale av proteomikk teknologi til en dybde sammenlignbar med nukleinsyre sekvensering og microarray teknikker åpner nye perspektiver i biomarkør og narkotika target oppdagelse. Den beskrevne protokollen gjør det mulig karakterisering og kvantifisering av proteomes av populasjoner av microdissected celler på en skala fra 10.000 proteiner. Ved bruk av mindre av den microdissected materiale et mindre datasett kan genereres, men kanskje i mange tilfeller de kan også gi verdifulle kliniske data. Således kan enten prøvene analyseres direkte etter MED-FASP prosedyre eller kan separeres i mindre fraksjoner. Siden FASP prosedyren er kompatibelt med hvilken som helst type protease, kan andre enzymer eller deres kombinasjon brukes fra protein digestions 6. Kvaliteten på FFPE materialet synes å være den mest kritiske utgave av analysen. Vi har opplevd at den faste vev av samme opprinnelse, men kommer fra forskjelligent klinikker hadde distinkte egenskaper. Ved å bruke vev fra en kilde var vi i stand til å generere peptider i høyt utbytte, mens det liknende materiale fra et annet klinikken var nesten ubrukelig. Det er sannsynlig at den anvendte fiksering og integreringsfremgangsmåter, så vel som lagringsbetingelser er de viktigste faktorer som påvirker egenskapene til det kliniske materialet 12. Derfor er det lurt å teste egenskapene til noen prøver før du starter et større prosjekt. Mange publikasjoner rapportert bruken av FFPE materialet i det siste. Men antall proteiner identifisert i disse studiene oversteg aldri mer enn 1000-2000 proteiner fire. Tatt i betraktning av størrelsen av de humane cellespesifikke proteomes som består av mer enn 10.000 proteiner, slike studier var i stand til bare å gi en meget overfladisk bilde, nesten begrenset til meget rikelig proteiner involvert i dag funksjoner. Vår protokollen muliggjør effektiv isolering av klinisk eller biologisk materiale from konservert vev, og er optimalisert for lysering, proteinprosessering og peptid prefraksjonering. Som en konsekvens vår prøvepreparering arbeidsflyt, når den er koblet til det avanserte massespektrometri, tillater innsikt i en nesten fullstendig proteomes. Bemerkelsesverdig, er dette mulig på minuttet prøven beløpskrav. Den store fordelen med å bruke de bevarte vev er deres relative bred tilgjengelighet. FFPE arkivert i mange år og tiår, og noen ganger ansett som ubrukelig, nå, takket være proteomikk teknologi, fremstår som svært verdifullt materiale for klinisk forskning. Mens mange sykdommer kan studeres ved hjelp av fersk eller frosset materiale undersøkelse av FFPE materiale synes å være spesielt viktig for å studere sjeldne sykdommer 12, var samling av et representativt sett av prøven tar vanligvis lang tid.

Feste med paraformaldehyde og innstøping i parafin (FFPE) er standard metode for konservering og pathomorphologic etterforskning av klinisk vev materiale. Mikroskopi av bevart vev tillater identifisering av sykdomsrelaterte morfologiske endringer, og påvisning og scoring av forekomsten av sykdomsrelaterte antigener. Siden vanligvis bare en liten del av den FFPE prøven blir brukt i disse analysene, store mengder av klinisk materiale forblir arkivert og kan utnyttes i andre typer studier. Under det siste tiåret forskning innen life sciences har blitt styrket av den kraftige proteomikk teknologi. Denne teknologien gjør det mulig for identifisering og kvantifisering av tusenvis av proteiner i komplekse proteinblandinger. Et viktig trekk ved den teknologi er at bare små mengder av materiale som er nødvendig for storskala-analyser. Nyere proteomikk studier vist at proteiner kan studeres på en skala fra nesten kompLete proteomes 1, 2. Slike undersøkelser kan hele systemet innsikt i sammensetningen av cellene og identifisering av grupper av proteiner som forekommer ved avvikende nivåer i sykdommer. Mens disse studiene krevde store massespektrometri kapasiteter, har den siste arbeid vist at tilsvarende grad av identifisering kan oppnås innenfor en enkelt dag måle tre. Kravet til relativt lav sample beløp og den store tilgjengeligheten av de bevarte kliniske prøver fristet oss og andre for å utvikle metoder slik at proteomikk utforskning av FFPE materiale (for en gjennomgang se 4). Å dra nytte av reversibilitet av formalin fiksering under en varmebehandling vi har utviklet en protokoll som tillater kvantitativ ekstraksjon av proteiner fra fast vev fem. Vi har vist at festemåten bevarer ikke bare proteiner, men også i det minste noen posttranslational modifikasjoner. Fosfatorylation og N-glykosylering kan studeres ved hjelp av FFPE 5, men en forutsetning for det er en grundig kontrollert vev innsamling, lagring og festeforhold. Deretter har vi optimalisert fremgangsmåte for en laser-fangst mikrodisseksjon av det faste vev og for proteomikk reaktoren baserte prøvebehandling 6, 7. En stor skala studie på tykktarmskreft tillatt kvantitativ analyse av 7500 proteiner fra microdissected fra klinisk materiale åtte. Endelig har vi forbedret veien for utforskning av microdissected materialet ved å bruke rad-to trinn protein fordøyelse protokoll 9. I sammenligning med de vanlige fordøyelse ved hjelp av strategier enkelt enzym, gjør denne fremgangsmåten generering av flere sekvensavhengige peptider, og følgelig resulterer i en større dybde av protein identifikasjon. Analyse av microdissected menneskelig adenom tillatt proteomikk analyser til en dybde på 9500 proteiner per prøve tre. I denne study vi kartlagt 55000 peptider per prøve slik at identifisering av 88-89% proteiner med minst to peptider. Her presenterer vi en optimalisert protokoll for preparering av prøver fra FFPE materialet for LC-MS/MS analyse. Denne protokollen omfatter utarbeidelse av vev skiver for microdissection, lyse av de isolerte celler, og utvalgets behandling i en reaktor format (FASP) 6. Deretter vi beskrive en spektrofluorometriske bestemmelse av peptid utbytter, en aktivitet med høy viktighet for optimal peptid identifisering av massespektrometri. Til slutt viser vi en sterk anionbytter (SAX) basert separasjonsteknikk for peptid fraksjonering. I denne fremgangsmåten både peptidet separasjon og Sluttrengjoering blir utført ved hjelp av pipette-spissen microcolumns 10, 11. Dette trinnet er valgfritt, men anbefales i studier der mer enn noen få mikrogram peptider kan fås fra en enkelt prøve. Den SAX-fraksjonering kan øke antallet og dynamisk spekter av identfikasjoner og forlenge proteinsekvens dekning 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Bevarte klinisk materiale er en unik kilde for proteomikk etterforskning av menneskelige lidelser. Her beskriver vi en optimalisert protokollen tillater storskala kvantitativ analyse av formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) vev. Prosedyren består av fire forskjellige trinn. Den første er utarbeidelsen av seksjoner fra FFPE materiale og microdissection av celler av interesse. I det andre trinn de isolerte celler blir lysert, og behandlet ved hjelp av (FASP) teknikken &quot;filter styrt prøvepreparering &#39;. I dette trinnet blir proteiner utarmet fra reagenser anvendt for prøven lyse og oppsluttes i to trinn ved bruk av endoproteinase LysC og trypsin. Etter hver fordøyelsen, er peptidene som samles i adskilte fraksjoner og deres innhold som bestemmes ved hjelp av en meget følsom fluorescens-måling. Endelig er de peptider fraksjonert på &#39;pipette-tip&#39; microcolumns. De LysC-peptider er delt inn i fire fraksjoner mens tryptiske peptides er delt inn i to fraksjoner. På denne måte fremstilte prøver tillate analyse av proteomes av små mengder av materialet til en dybde på 10.000 proteiner. Således er den beskrevne arbeidsflyten en kraftfull teknikk for å studere sykdommer hos en systemomfattende-måte, så vel som for identifisering av potensielle biomarkører og narkotika mål.

Proteomikk analyser av FFPE materialet krever robuste og reproduserbare metoder for prøveopparbeidelse. I denne publikasjonen demonstrerer vi en protokoll som tillater effektiv isolering av cellepopulasjoner fra det faste materiale og deres kjemisk behandling som resulterer i høy renhetsgrad peptid-fraksjoner som kan bli direkte benyttet for LC-MS/MS analyse. Fremgangsmåten består av fire atskilte deler: (1) Fremstilling av deler av FFPE-prøver og dens mikrodisseksjon, (2) lysering av prøven og behandling av proteinene ved hjelp av MED FASP tilnærming, og (3) kvantifisering og (4) fraksjonering av peptidene (figur 1). I det første trinn av fremgangsmåten i FFPE-prøver er seksjonert med en mikrotom og montert på membrandekket lysbilder. For å øke adhesjonen mellom de vevssnitt og overflaten av glide membranen er nødvendige for å bestråle glideflate med UV-lys. For dette formålet bruker vi lyset fra en ultrafiolett lampeintegrert i en cellekultur benk. Etter dette trinnet skinnene er utsatt for vaskinger som tillater fjerning av parafin-og rehydrering av prøvene. Den rehydrert materialet er farget med hematoksylin i en kort tid. Dette resulterer i en svak farging av prøven, men er tilstrekkelig for visualisering av eksempel områder for mikrodisseksjon. Fargingen prosessen må stoppes raskt ved skylling av skinnene med et overskudd av vann. En langvarig farging av prøveresultatene i fattige peptid avkastning. I det neste trinn de tørkede delene utsettes for mikrodisseksjon. Utvelgelsen av de vevsområder av individuelle celler er avhengig av type av undersøkelse og alltid krever spesielle kunnskaper i histologi eller pathomorphology. Laseren-utgitt materiale er samlet på limsiden av prøvetakingsrørene. Siden bindingsevnen til klebemiddelmateriale er begrenset er det nødvendig å overføre microdissected materiale fra lokket til tHan røret etter disseksjon av hver 3-5 mm 2 i prøven. Dette kan enkelt gjøres ved pipettering av noen få mikroliter av vevet lysis buffer (LTB) på lokket, og en kort sentrifugering av røret i en sentrifuge. Etter at prøven er samlet i bunnen av røret, kan det mikrodisseksjon og prøvetakingen på lokket føres. Når hele prøven er samlet rørene må i tillegg bli propp med Parafilm og inkubert i et vannbad ved ca 99 ° C med kontinuerlig omrøring i 1 time. Siden under inkuberingen vann kondenseres på lokket, hvert 15 min i rørene må være kort sentrifugert for å samle tilbake vannet i røret kjegle. For å få peptider vevet lysatene er behandlet ved hjelp av MED-FASP tilnærming. I denne fremgangsmåten de lyserte proteiner er utarmet på løsemiddel og andre lavmolekylære stoffer, carboamidomethylated ved cysteinyl rester, og deretter fortløpende spaltet med to enzymer forskjelfering i deres cleavage særegen: endoproteinase LysC og trypsin. Etter hvert fordøyelse trinn peptidene oppsamles i separate fraksjoner. I denne delen av prøvepreparering, er det viktig å fortsette hver av sentrifugeringsfremgangsmåten inntil mer enn 95% av løsningen som opprinnelig er lastet inn i filtreringsenheten passert membranen. Analysere colonic vev og dets cancer vi har observert at denne fremgangsmåten utbytter 3-6 mikrogram av peptidet pr 100 nl (100 mg vev eller 10 mm 2 av en 10 mm seksjon) av microdissected materiale (tabell 1). Siden den ekstraherbare total protein fra vev er omtrent 10% av vevet vekt på avtrekks-og fordøyelsesprosedyrer sammen resulterer i et utbytte på 30-60% i forhold til det opprinnelige friske vev. Disse verdiene reflekterer tap av proteinet under dehydrering og beising, mikrodisseksjon og oppbevaring av det parti av ufordøyd prøven i ultrafiltreringsenhetene. Fordi utvinning og prosessering av non-microdissected FFPE vev resulterte i protein-til-peptid-konvertering utbytte på 75% 5 er det sannsynlig at de kritiske tapene prøven forekommer i løpet av trinnene før MED-FASP. Et viktig trekk ved peptid-blandinger som oppnås ved denne fremgangsmåten er den høye renhetsgrad som letter ytterligere fraksjone peptid fraksjoneringsprosessen og massespektrometri identifikasjon. Det har nylig blitt vist ved en analyse av kolorektal adenom prøvene 3. I den studien ca 40% av de MS / MS-arrangement ført til identifiseringen av peptider fra FFPE vev og resulterte i kartlegging av opp til 17000 peptider per enkelt LC-MS/MS løp. Høyere identifikasjons priser er oppnådd bare i analyse av frosne in vitro dyrkede celler tre. I de to siste delene av hele prosedyren de isolerte peptider er kvantifisert og fraksjonert på pipette-tip microcolumns. Siden mengdene av peptid isolert fra microdissected vev er blilav 10 mikrogram de ikke kan kvantifiseres ved hjelp av brukte dye-basert protein analyser. Også A 280 UV-spektrale målinger ved disse konsentrasjonene er ikke nyttig på grunn av lysspredning effekt. I kontrast til målinger av fluorescens av tryptofan rester gi en pålitelig måte for bestemmelse av den peptid-innhold. Nylig har vi vist at opp til 5000 proteiner fra dyrkede celler kan identifiseres i en &quot;single shot&quot; 4 timers LC-MS/MS analyse 7. Men denne typen analyse anvendt på innfødte vev sjelden tillater identifisering av mer enn 3000 tusen proteiner. For å øke med dybden av analysen peptidene generert på MED FASP må være forhånds fraksjoneres før LC-MS/MS. Den SAX baserte mikro-kolonne separasjon er en enkel og effektiv fraksjone metode 10. Det har allerede blitt brukt i flere proteomikk studier inkludert de analysere fast vev 5, 8, 9. Den SAX-&#39;pipette-tip&#39; microcoluMNS, og C 18 - &#39;StageTip&#39; avsalting kolonner 9 er enkle å tilberede. Søylene er satt sammen av stabling av plugger, kuttet fra SAX eller C 18 membraner, i en 200 mL pipette 11. Eksempler på analysen av SAX-fraksjonert FFPE-prøver er vist i tabell 1.. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figur 1. Oversikt prosedyre. Fremgangsmåten består av fire atskilte deler: (1) Fremstilling av deler av FFPE-prøver og dens mikrodisseksjon, (2) lysering av prøven og behandling av proteinene ved hjelp av MED FASP tilnærming, og (3) kvantifisering og (4) fraksjonering av peptider. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Sample </td><td fo:width="1in"> Sample pre-fraksjonering / fordøyelse </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Massespektrometer brukes </td><td fo:width="1.25in"> Peptid avkastning ng / nL sample (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Unike Protein Identifikasjoner Per enkelt prøve </td><td fo:width=".75in"> Referanse </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Normal colonic mucosa </td><td> SAX / ett enzym </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • adenom </td><td> SAX / to enzymer </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Representative resultater av proteomikk analyser av FFPE microdissected vev.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Archival formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) kliniske prøver er verdifullt materiale for undersøkelse av sykdommer. Her viser vi en prøveopparbeidelse arbeidsflyt slik i dybden proteomikk analyser av microdissected FFPE vev.

Proteomikk Prøvepreparering fra formalinfiksert og parafin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MikroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering for formalinfiksert Nyre Vev

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR er en følsom og rask metode for påvisning av Cytomegaloviruspneumonitt DNA i formalinfiksert, parafin-embedded vevsprøver

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Ansette Digital Droplet PCR å oppdage BRAF V600E Mutasjoner i formalinfiksert parafininnstøpte Reference Standard cellelinjer

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Utarbeidelse av formalinfiksert parafin-innebygde Tissue-kjerner for både RNA og DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...