Name: proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Автор благодарит д-р Маттиас Манн за постоянную поддержку и миссис Katharina Zettl для демонстрации метода. Эта работа была поддержана Макса Планка общества содействия развитию науки.

1. Инструменты Обязательные <ol><li> Подготовка срезах тканей для микродиссекции и образца лизиса <ol><li> Термоблок установлен на 99 ° С или ванну с кипятком. </li><li> Лазерная операционной microdissector (например PALM, Zeiss, Геттинген, Германия). </li><li> Термостатировали настольная центрифуга, температура устанавливается на 20 ° C. </li><li> Мокрый камера (коробка) со стойкой для утилизации труб Эппендорф типа. </li><li> Инкубатор установлен на 37 ° С </li><li> Спектрофлуориметр позволяет измерять флуоресценции, возбуждаемой около ультрафиолетового света с микро-масштабе кварцевых кюветах (0,1-0,2 мл). </li></ol></li></ol> 2. Решения <ol><li> &quot;Tissue лизирующего буфера&quot; (TLB): 0,1 М Трис-HCl, рН 8,0, 0,1 М DTT, 0,5% (м / о) полиэтиленгликол 20000 и 4% SDS. </li><li> UA раствор: 8 М мочевины в 0,1 М Трис-HCl рН 8,5. Подготовить 1 мл на 1 образца. Решения UA и IAA должны быть готовы недавно и используются в течение дня. </li><li> Решение МАА: 0,05 М яodoacetamide в UA. Подготовьте 0,1 мл на 1 образца. </li><li> Эндопротеиназой Lys-C, раствор. </li><li> Трипсин, раствор. </li><li> &quot;Расщепление буфер &#39;(DB): 0,05 М Трис-HCl рН 8,5. Подготовить 0,25 мл на 1 образца. </li><li> &quot;Стандартный раствор Триптофан &#39;: 0,1 мкг триптофана в 1 мл деионизированной воды. </li><li> &quot;Тест-буфер B &#39;(ABB): 10 мМ Трис-HCl, рН 7,6. </li><li> Исходный раствор Бриттон &amp; Robinson Всеобщей буфера (BRUB). Приготовить раствор, содержащий 0,1 М CH 3 COOH, 0,1 М H 3 PO 4, 0,1 и MH 3 BO 3 и регулировать с помощью 1 М NaOH до требуемого рН (2, 4, 5, 6 и 11). Перед использованием разбавить в 5 раз деионизированной водой. </li><li> Буфер А: 1% (V / V) СН 3 СООН в деионизированной воде. </li><li> Буфер Б: 60% (об / об) CH 3 CN, 1% (об / об) CH3COOH в деионизированной воде. </li></ol> 3. Пипетки и Столбцы &quot;StageTip &#39; <ol><li> Подготовьте путем укладки 6 слоев Empore-аниона мембраны в сотрудничестве SAX наводку колонкиMMON 0,2 мл пипетки. Сделайте два SAX-наконечник столбцы на один образец. </li><li> Подготовьте &#39;StageTip&#39; путем укладки 3 слоя Empore-C 18 в пипетки 0,2 мл. Сделать 6 советов сцена для каждого образца. </li></ol> 4. Подготовка тканей фрагментов для микродиссекция и образцы Lysis <ol><li> Вырезать секции с микротоме (толщина срезов зависит от образца. Обычно микродиссекции хорошо работает с кусочками 7-10 мкм). </li><li> Облучают мембранные слайды (MembraneSlide 1.0 PEN) УФ-светом в течение 45 мин. </li><li> Установите разделы, посвященные облучать мембранных горками и сухим при 37 ° С в течение 2 часов. </li><li> Deparaffinize смонтированные секции двумя последовательными инкубации в ксилоле в течение 2,5 мин и 1,5 мин. Увлажняет секции последовательными инкубации в абсолютном этаноле, 70%-ным этанолом и водой, каждый в течение 1 мин. </li><li> Пятно секции с гематоксилином Майера в течение 20 сек, промойте водой в течение 1 мин, и воздушно-сухой. </li><li> Соберите сотовые populatiна интерес, используя систему микродиссекции лазерной съемки. При использовании PALM инструмент (Zeiss) собрать образцы в клее шапки (клей CAP 200). </li><li> Пипетки аликвоту TLB по микродиссекции материала в крышке. Закройте трубку и собирать подвеску с помощью короткого центрифугирования. Lyse микродиссекции ткань при 99 ° С в нагревательном блоке при перемешивании (600 оборотов в минуту) в течение 1 часа. С помощью 3 мкл буфера для 10 нл от микродиссекции ткани. </li><li> Уточнение неочищенного экстракта центрифугированием при 16000 х г при 18 ° С в течение 10 мин. Лизат можно хранить в замороженном виде при -20 ° С. </li></ol> 5. Образец Обработка <ol><li> Смешать до 50 мкл осветленной лизата с 200 мкл UA при ультрафильтрации единиц (судебной 30k) и центрифуге при 14000 х г до менее чем 10 мкл раствора будет оставаться в фильтре. Обычно этот шаг требуется 10-15 мин центрифугирования. </li><li> Внесите 200 мкл UA к ультрафильтрациии центрифуги, как в 5.1. Слейте сбора трубку. </li><li> 50 мкл раствора IAA и смешать при 600 оборотах в минуту в термо-миксера в течение 1 мин и центрифуги, как в 5.1. </li><li> Внесите 100 мкл UA к устройству ультрафильтрации и центрифуги, как в 5.1. Повторите этот шаг дважды </li><li> Внесите 100 мкл БД в блок ультрафильтрации и центрифуге при в 5.1. Повторите этот шаг дважды. </li><li> Перенесите модулями фильтрации в новые пробирки сбора. Пипетка 40 мкл DB с эндопротеиназой Lys-C (протеиназы, чтобы соотношение общий белок 1:100) и перемешивают при 600 оборотах в минуту в термо-смесителе в течение 1 мин. Инкубируйте единиц во влажной камере при 37 ° С в течение 18 часов. </li><li> Центрифуга устройства фильтрации при 14000 мкг например, в 5,1. </li><li> Внесите 160 мкл деионизированной воды и центрифуги фильтрующих блоков, как в 5.1. Объединенный проточный (5.7 и 5.8 шага) содержит пептиды, выделяемые эндопротеиназой Lys С. </li><li> Перенести ультрафильтрационного устройства на новую пробирку. Добавить 40 мклDB трипсином (фермента с белком соотношении 1:100) и перемешивают при 600 оборотах в минуту в термо-смесителе в течение 1 мин. Инкубируйте единиц во влажной камере при 37 ° С в течение 4 часов. Повторите шаги 5.7 и 5.8 для сбора триптических пептиды. </li></ol> 6. Количественное определение пептидов <ol><li> Измерение содержания пептидов в белковых гидролизатов могут быть выполнены в разбавленной буфера, так как триптофан остатки хорошо доступной для растворителя. </li><li> Внесите 0,2 мл ABB в кварцевую кювету и записать спектр излучения для &#39;пустой&#39;. </li><li> Подготовка калибровочной кривой с использованием 0,1 мкг шаги добавлением 1 мкл аликвоты TSS в кювету и нежный смеси с АББ. </li><li> Очистите кювету. </li><li> Внесите пробу и регистрировать спектр (образец). </li><li> Рассчитать концентрации белка и пептида Так как 0,1 мкг триптофан соответствует примерно 9 мкг белка (на основе среднего 1,1% триптофана контента в белковых смесей, полученных бу лизиса клеток человека) содержание белка в содержании образца или пептида в сборнике равна: <img alt="Уравнение 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> где F (стандартная1) является флуоресценция 0,1 мкг триптофана стандарта. Содержание пептида позволяет рассчитать доходность процедуры пищеварения и обеспечивает необходимую информацию для следующих пептидный фракционирования и масс-спектрометрического анализа. </li></ol> 7. Фракционирование Lys-C и триптических пептидов <ol><li> Развести пептидные растворы, полученные путем переваривани с Lys-C и трипсина с 0,2 мл BRUB рН 11 и рН 5, соответственно. </li><li> Соберите SAX наводку столбец в центробежный крышкой адаптер трубки. </li><li> Промыть и уравновесить SAX колонку наводку последовательно 0,1 мл метанола, 0,1 мл 1 М NaOH и три раза 0,1 мл, рН BRUB 11 для разделения Lys-C Peptiде и с BRUB, рН 5 для триптических пептидов. Поток решений через материал колонке облегчается путем центрифугирования при 4000 х г. </li><li> Мытье и уравновешивания C 18 - &#39;StageTips&#39; впоследствии с 0,05 мл метанола, затем с 0,05 мл буфера В и с 0,05 мл буфера A. Подготовка шесть C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 для разделения Lys- C пептиды и две для разделения триптических пептидов. </li><li> Соберите SAX Tip-столбец в C 18 - &#39;StageTip&#39;. Загрузите примеры решения в равновесии SAX TIP-столбцов и центрифуги столбцы в 5000 мкг в течение 3 мин. </li><li> Уравновесить &quot;пипетка-совет &#39;столбцы с 0,1 мл BRUB, рН 11 или рН 5, соответственно к Lyc-C и триптических образцов. Содействовать притоку путем центрифугирования при 5000 х г. </li><li> Перенести Tip-колонки SAX к следующему С 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Продолжить элюирующего пептидов с BRUB рН 6, 4 и 2 для образца Lys C и с BRUB рН 2 для образца с триптических пептидов. Для каждого шага элюирования использовать отдельный C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Вымойте C 18 - &#39;StageTips&#39; с 0,05 мл буфера A. </li><li> Элюции фракции с 0,05 мл буфера В в пробирки, используемых для инъекций непосредственно из образцов в системе LC собранных с помощью масс-спектрометра. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

Автор не имеет ничего раскрывать.

Возможность изучать FFPE материал по протеомного технологии на глубину сопоставимой с секвенирования нуклеиновых кислот и методов микрочипов открывает новые перспективы в биомаркеров и целевой лекарственных препаратов. Описанный протокол позволяет характеристику и количественную оценку протеомов популяций микродиссекции клеток по шкале от 10 000 белков. При использовании менее в микродиссекции материала через небольшие наборы данных могут быть созданы, но, возможно, во многих случаях те, также может обеспечить ценные клинические данные. Таким образом, либо образцы могут быть проанализированы непосредственно после процедуры MED-FASP или могут быть разделены на менее фракций. Поскольку процедура ФАСП совместим с любым типом протеазы, другие ферменты или их комбинации можно использовать из белковых пищеварения 6. По-видимому, самый важный вопрос анализа Качество FFPE материала. Мы испытали, что фиксированная ткань того же происхождения, но исходя из отличатьсяЛОР клиники были различными свойствами. Использование ткани из одного источника, мы смогли произвести пептидов при высоких урожаев, тогда как аналогичный материал из другого клинике было практически бесполезно. Вполне вероятно, что применяется фиксация и вложения процедуры, а также условия хранения являются основными факторами, влияющими на свойства клинического материала 12. Поэтому целесообразно тестировать несколько свойств образцов перед началом больший проект. Многие издания сообщили об использовании в FFPE материала в прошлом. Тем не менее, количество белков, идентифицированных в этих исследованиях не превышала более 1000-2000 белки 4. Принимая во внимание размер человеческих конкретных протеомов клеток, составляющих более 10 000 белков, такие исследования смогли только обеспечить весьма поверхностное картину, почти ограничивается весьма обильных белков, участвующих в функции домашнего хозяйства. Наш протокол позволяет эффективно изолировать клинической или биологической материальной ером сохраняется ткань и оптимизирован для лизиса, обработки белка и пептида фракционирование. Как следствие наша подготовка рабочего процесса образец, в сочетании с масс-спектрометрии высокого класса, позволяет взглянуть на почти полное протеомов. Примечательно, что это возможно в минуту требований количество пробы. Основное преимущество использования сохранившиеся ткани является их относительная широкая доступность. Образцы FFPE архивируются в течение многих лет и десятилетий, а иногда рассматривается как бесполезно, теперь, благодаря протеомного технологии, появляются как высоко ценный материал для клинических исследований. В то время как многие болезни могут быть изучены с помощью свежие или замороженные материальную расследование FFPE материала, кажется, особенно важно для изучения редких заболеваний 12, были сбор представитель набор образца обычно занимает много времени.

Крепление с параформальдегидом и встраивания в парафин (FFPE) является стандартным методом для сохранения и патоморфологического исследования материала клинической ткани. Микроскопия сохранившейся ткани позволяет идентифицировать болезнь, связанная морфологических изменений и обнаружения и счет возникновения заболеваний, связанных с антигенами. Так как обычно лишь небольшая часть образца FFPE используется в этих анализах, большое количество клинического материала остаются в архиве и могут быть использованы в других типах исследований. В последнее десятилетие исследования в области наук о жизни была усилена мощной протеомного технологии. Эта технология позволяет идентификация и количественное определение тысяч белков в сложных белковых смесей. Важной особенностью технологии является то, что только незначительное количество материала необходимы для крупномасштабного анализа. Последние протеомические исследования показали, что белки могут быть изучены по шкале от почти компLete протеомов 1, 2. Этот тип исследований позволяет системным широкие идеи в составе клеток и идентификации групп белков, происходящих при аномальных уровней в заболеваний. В то время как эти исследования необходимы большие мощности масс-спектрометрический, недавняя работа показала, что похож степень идентификации может быть достигнуто в течение одного дня измерения 3. Требование относительно низким количеством образца и широкая доступность сохранившихся клинических образцов соблазн нас и других в разработке методов, позволяющих протеомный исследование в FFPE материала (см. обзор 4). Воспользовавшись обратимости фиксации формалином под термообработки мы разработали протокол, позволяющий количественно добычу белков из фиксированного ткани 5. Мы показали, что процедура фиксации сохраняет не только белки, но и по крайней мере некоторые посттрансляционных модификаций. Фосфорorylation и N-гликозилирования могут быть изучены с помощью FFPE образцы 5, однако необходимым условием для это тщательно контролируемых условиях сбора ткани, хранения и фиксации. Далее, мы оптимизировали метод лазерного захвата микродиссекции фиксированной ткани и для протеомного обработки образцов реактора на основе 6, 7. Крупномасштабная исследование по колоректального рака разрешено количественный анализ 7500 белков из микродиссекции из клинического материала 8. Наконец, мы улучшили способ освоения микродиссекции материала, применяя последовательно-два шага переваривания белков протокол 9. По сравнению с общей стратегии пищеварения с использованием одного фермента, эта процедура позволяет генерировать более последовательностей-уникальный пептидов и, следовательно, приводит к увеличению глубины идентификации белков. Анализ микродиссекции человека толстой аденомы разрешено протеомный анализ на глубину 9500 белков в образце 3. В этом шпилькиу нас отображены 55000 пептидов на образец, позволяющий идентифицировать 88-89% белков с по крайней мере два пептидов. Здесь мы представим оптимизированный протокол для подготовки проб от FFPE материала для анализа LC-MS/MS. Этот протокол включает подготовку срезах тканей для микродиссекции, лизис изолированных клеток и обработка образца в формате реактора (ФАСП) 6. Затем мы описываем спектрофотометрическим определение урожайности пептидных; задачу с высокой важностью для оптимальной идентификации пептидов по масс-спектрометрии. Наконец, мы демонстрируем сильный анионит (SAX) на основе методики разделения для пептида фракционирования. В этом методе как разделение пептид и последний очистка осуществляются с использованием пипетки-наконечник Микроколонки 10, 11. Этот шаг является необязательным, но рекомендуется в исследованиях, в которых более нескольких микрограмм пептиды могут быть получены из одного образца. SAX-фракционирование может существенно увеличить количество и динамический диапазон идентifications и расширить охват последовательность белка 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Сохранилось клинический материал является уникальным источником для протеомного расследования нарушений в организме человека. Здесь мы опишем оптимизированный протокол, позволяющий крупномасштабное количественный анализ формалина фиксированной и парафин (FFPE) ткани. Процедура включает в себя четыре различных шагов. Первый препарат из секций с FFPE материала и микродиссекции клеток, представляющих интерес. На втором этапе выделенные клетки лизируют и обработаны с использованием автоматизированного фильтра &#39;пробоподготовки&#39; (FASP) методике. На этом этапе белки обедненный из реагентов, используемых для лизиса пробы и перевариваются в двух шагов, используя эндопротеиназную LysC и трипсина. После каждой варки, пептиды собирают в отдельные фракции и их содержание определяется с использованием высокочувствительного измерения флуоресценции. Наконец, пептиды на фракции на «пипетка-совет &#39;микроколонках. В LysC-пептиды разделены на четыре фракции, тогда как трипсином PEptides разделены на две фракции. Таким образом, подготовленные образцы позволяют анализ протеомов от незначительных количеств материала на глубину 10000 белков. Таким образом, описанный рабочий процесс является мощным средством для изучения заболеваний в общесистемной-моды, а также для выявления потенциальных биомаркеров и лекарственных препаратов.

Протеомный анализ FFPE материала требуется надежные и воспроизводимые методы для пробоподготовки. В этой публикации мы показали, протокол позволяет эффективное выделение клеточных популяций из фиксированного материала и их химической обработки, что приводит к высокой пептидных фракций чистоты, которые могут быть непосредственно использованы для анализа ЖХ-МС/МС. Процедура состоит из четырех отдельных частей: (1) Получение срезов образцов FFPE и его микродиссекции, (2) лизиса пробы и обработки белков с использованием MED FASP подход, и (3) количественного и (4) фракционирования пептиды (рис. 1). В первом шаге процедуры образцы FFPE подразделяются с микротоме и установлен на мембранных покрыты слайдов. Для увеличения адгезии между срезах тканей и поверхностью ползуна мембраны необходимо облучать поверхность скольжения с ультрафиолетовым светом. Для этой цели мы используем свет ультрафиолетовой лампыинтегрированы в культуры клеток скамейке. После этого шага слайды подвергают стирок, позволяющих удаление парафина и регидратации образцов. Регидратации материал окрашивали гематоксилином в течение короткого времени. Это приводит к слабой окраски образца, но достаточно для визуализации образца областей для микродиссекции. Процесс окрашивания должен быть быстро остановлен путем промывки из слайдов с избытком воды. Продлен окрашивание образца приводит к плохой выход пептидных. На следующем этапе высушенные секции подвергают микродиссекции. Отбор тканей областях отдельных клеток зависит от типа исследования и всегда требует специальных знаний в гистологии или патоморфологии. Лазерный выпущен материал собирали на клейких поверхностей трубок отбора образцов. Поскольку связывающей способности клеевого материала ограничено, необходимо передать микродиссекции материал от крышки к тон трубка после вскрытия каждого 3-5 мм 2 образца. Это можно легко сделать с помощью пипетки нескольких мкл буфера ткани лизиса (LTB) на крышке и короткий спиннинг трубки в центрифуге. После того как образец собирают в нижней части трубки, микродиссекции и сбор образцов на крышке может быть продолжен. После того, как весь образец собирают трубы должны быть дополнительно пробкой парафильмом и инкубировали в водяной бане при температуре около 99 ° С при непрерывном перемешивании в течение 1 часа. Так как во время инкубации воды конденсируется на крышке, через каждые 15 мин трубы должны быть вскоре центрифугировали, чтобы собрать обратно воду в трубки конуса. Для получения пептидов тканевые лизаты, обрабатываются с использованием подхода MED-FASP. В этом методе лизированные белки истощаются от моющего средства и других низкомолекулярных веществ, carboamidomethylated на цистеинил остатков, а затем последовательно переваривают двух ферментов различмешающее в своих особенностей расщепления: эндопротеиназы LysC и трипсин. После каждой стадии варки пептиды собирают на отдельные фракции. В этой части пробоподготовки важно, чтобы продолжать каждом из этапов центрифугирования до более чем 95% раствора первоначально загруженного в устройство фильтрации проходил через мембрану. Анализ толстой ткани и ее рак мы наблюдали, что эта процедура дает 3-6 мкг пептида на 100 нл (100 мкг тканевого или 10 мм 2 секции 10 мкм) из микродиссекции материала (табл. 1). Поскольку съемный общего белка из тканей составляет около 10% от веса ткани процедуры извлечения и пищеварения вместе с выходом привести в относительно исходного свежей ткани 30-60%. Эти значения отражают потери белка во время дегидратации и окрашивания, микродиссекции и хранения той части непереваренной образца в ультрафильтрационных единиц. Потому что добыча и переработка нетн-микродиссекции FFPE ткани привело к белково-на-пептид-преобразования выходом 75% 5 Вполне вероятно, что критические потери образца происходят во время шагов до MED-FASP. Важной особенностью пептидных смесей, полученных с помощью этой процедуры является их высокая чистота что облегчает дальнейшее фракционирование пептида процесс фракционирования и идентификации масс-спектрометрии. Это недавно было показано путем анализа образцов колоректального аденомы 3. В этом исследовании 40% событий МС / МС привело к идентификации пептидов из FFPE ткани и в результате отображения до 17000 пептидов на одной LC-MS/MS перспективе. Более высокие темпы идентификации были достигнуты только в анализе замороженных культивируемых клеток в пробирке 3. В двух последних частях всей процедуры изолированной пептиды количественно и фракционированного на пипетка-Tip микроколонках. Так как количество пептида, выделенные из ткани микродиссекции бытьнизкий 10 мкг они не могут быть количественно с помощью обычно используемых красителей на основе белка анализов. Также измерения УФ-спектрального 280 в этих концентрациях не являются полезными в связи с световой эффект рассеяния. В противоположность этому, измерения флуоресценции остатков триптофана предложить надежный путь для определения содержания пептидов. Недавно мы показали, что до 5000 белки из культивируемых клеток могут быть идентифицированы в &quot;одним выстрелом&quot; 4 ч ЖХ-МС/МС анализа 7. Однако этот вид анализа применяется для родных тканей редко позволяет выявление более чем 3000 тысяч белков. Для увеличения глубины анализа пептиды, полученные в MED FASP должны быть предфракционировались до LC-MS/MS. SAX основан разделение микро-столбец является простой и эффективный метод фракционирования 10. Это уже применяется в нескольких протеомных исследований в том числе анализа фиксированный ткани 5, 8, 9. SAX-&#39;пипетки-наконечник &quot;microcoluМНБ и C 18 в - обессоливания колонн &#39;StageTip&#39; 9 легки в приготовлении. Колонки собраны путем укладки пробок, вырезанные из SAX или С 18 мембраны, в оконечности мкл пипетки 200 11. Примеры анализа SAX фракционировали образцов FFPE показаны в таблице 1. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Рисунок 1. Обзор процедуры. Процедура состоит из четырех отдельных частей: (1) Получение срезов образцов FFPE и его микродиссекции, (2) лизиса пробы и обработки белков с использованием MED FASP подход, и (3) количественного и (4) фракционирования пептиды. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Образец </td><td fo:width="1in"> Образец предварительно фракционирование / пищеварения </strОнг&gt; </td><td fo:width="1in"> Масс-спектрометр используется </td><td fo:width="1.25in"> Выход Пептид нг / нл образец (± стандартное отклонение) </td><td fo:width="1.25in"> Уникальные Идентификации белка в одном образце </td><td fo:width=".75in"> Ссылка </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Нормальный слизистой оболочки толстой кишки </td><td> SAX / один фермент </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (N = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • Кишечное Аденома </td><td> SAX / два фермента </td><td> Вопрос Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (п = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Представитель результаты протеомических анализов микродиссекции ткани FFPE.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Архивное фиксированных формалином и парафином (FFPE) клинические образцы ценный материал для исследования заболеваний. Здесь мы показываем, подготовки рабочего процесса образец, позволяющий в глубины протеомный анализ микродиссекции FFPE ткани.

Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry: Парафин частей с помощью Vectastain ABC Kit Векторные Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Электрофоретического разделения белков

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Индукционная токсина и белка Извлечение из Fusarium Sрр. Культуры для протеомных исследований

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Вестерн-блоттинг: Подготовка образцов для обнаружения

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

МикроРНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация на формалин ткани почки

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

КПЦР является чувствительным и быстрый метод для обнаружения цитомегаловирусной ДНК в формалине фиксированной парафин биопсии ткани

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Используя цифровой капли ПЦР для обнаружения гена BRAF V600E Мутации в формалине фиксированной в парафин Ссылка на стандарт клеточных линиях

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Получение формалином фиксированных залитых парафином тканей Ядра как для РНК и ДНК экстракции

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...