Name: proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Författaren tackar Dr Matthias Mann för kontinuerligt stöd och fru Katharina Zettl för att demonstrera metoden. Detta arbete stöddes av Max-Planck-sällskapet för att främja vetenskap.

1. Instrumentering Krävs <ol><li> Beredning av vävnadssnitt för microdissection och prov lys <ol><li> Termoblock inställt på 99 ° C eller ett bad med kokande vatten. </li><li> Laserrörelse microdissector (exempelvis PALM, Zeiss, Göttingen, Tyskland). </li><li> Termostaterad bänkcentrifug, temperatur inställd på 20 ° C. </li><li> Våt kammare (fält) med ett rack för Eppendorf-typ bortskaffande rör. </li><li> Inkubator inställd på 37 ° C. </li><li> Spektrofluorometer möjliggöra mätning av fluorescens upphetsad nära UV-ljus med mikroskala kvartskyvetter (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Lösningar <ol><li> &quot;Tissue Lysis Buffer&quot; (TLB): av 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0,5% (vikt / volym) polyetylenglykol 20000 och 4% SDS. </li><li> UA lösning: 8 M urea i 0,1 M Tris-HCl pH 8,5. Bered en ml per 1 prov. UA och IAA lösningar måste beredas och användas inom en dag. </li><li> IAA-lösning: 0,05 M iodoacetamide i UA. Förbered 0,1 ml per 1 prov. </li><li> Endoproteinas Lys-C, stamlösning. </li><li> Trypsin, stamlösning. </li><li> &quot;Digestion buffert&quot; (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Förbered 0,25 ml per 1 prov. </li><li> &quot;Tryptofan standardlösning &#39;: 0,1 mikrogram tryptofan i 1 ml avjoniserat vatten. </li><li> &quot;Analysbuffert B &#39;(ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Stamlösning av Britton &amp; Robinson Universal Buffer (BRUB). Bered en lösning innehållande 0,1 M CH3COOH, 0,1 MH 3 PO 4, och 0,1 MH 3 BO 3 och justera med 1 M NaOH till önskat pH (2, 4, 5, 6 och 11). Före användning späds 5 gånger med avjoniserat vatten. </li><li> Buffert A: 1% (v / v) CH 3 COOH i avjoniserat vatten. </li><li> Buffert B: 60% (v / v) CH3CN, 1% (volym / volym) CH3COOH i avjoniserat vatten. </li></ol> 3. Pipettspetsen och &quot;StageTip &#39;Kolumner <ol><li> Förbered SAX tip-kolonn genom att stapla 6 lager Empore-Anjon membran i ett samarbetemmon 0,2 ml pipettspetsen. Gör två SAX-tip kolumner per prov. </li><li> Förbered &#39;StageTip &quot;genom att stapla tre lager av Empore-C 18 i ett 0,2 ml pipett spets. Gör 6 Stage tips för varje prov. </li></ol> 4. Beredning av vävnadssnitt för Microdissection och Sample Lysis <ol><li> Skär sektioner med en mikrotom (tjockleken på skivorna beror på provet. Vanligtvis mikrodissektion fungerar bra med skivor av 7-10 ^ m). </li><li> Bestråla membran diabilder (MembraneSlide 1,0 PEN) med UV-ljus i 45 min. </li><li> Montera avsnitten om de bestråla membran diabilder och torka vid 37 ° C under 2 timmar. </li><li> Avparaffinera de monterade delarna av två på varandra följande inkubationer i xylen för 2,5 min och 1,5 min. Rehydrera avsnitten av konsekutiva inkubationer i absolut etanol, 70% etanol och vatten, var och en i 1 min. </li><li> Färga sektioner med Mayers hematoxylin under 20 sekunder, sköljdes med vatten under 1 min, och lufttorka. </li><li> Samla cell populatiden av intresse med hjälp av laser capture microdissection systemet. Vid användning av PALM instrumentet (Zeiss) samla in proverna i de självhäftande lock (Lim CAP 200). </li><li> Pipettera en alikvot av TLB över microdissected materialet i locket. Förslut röret och samla suspensionen genom en kort centrifugering. Lysera microdissected vävnaden vid 99 ° C i ett värmeblock med omröring (600 rpm) under 1 timme. Använd 3 l av buffert för 10 nl av microdissected vävnaden. </li><li> Klargörande av råextraktet genom centrifugering vid 16.000 x g vid 18 ° C under 10 min. Lysatet kan förvaras frysta vid -20 ° C. </li></ol> 5. Provbearbetning <ol><li> Blanda upp till 50 | il av det klarnade lysatet med 200 | il av UA i ultrafiltreringsenheter (Forensic 30k) och centrifugera vid 14.000 x g till mindre än 10 ^ il av lösningen förblir i filtret. Vanligtvis detta steg kräver 10-15 min centrifugering. </li><li> Pipettera 200 l av UA till ultrafiltreringsenhetenoch centrifugera som i 5.1. Töm uppsamlingsröret. </li><li> Överför 50 ìl av IAA-lösning och blanda vid 600 rpm i en termomixer i 1 min och centrifugera som i 5.1. </li><li> Pipettera 100 l av UA till ultrafiltreringsenheten och centrifugera som i 5.1. Upprepa detta steg två gånger </li><li> Pipettera 100 ul av dB till ultrafiltreringsenheten och centrifugera vid i 5,1. Upprepa detta steg två gånger. </li><li> Överför filtreringsenheter till nya uppsamlingsrören. Pipettera 40 | il DB med endoproteinas Lys-C (proteinas till totalt proteinförhållande på 1:100) och blandas vid 600 rpm i termo-blandare under 1 min. Inkubera enheter i en fuktig kammare vid 37 ° C under 18 timmar. </li><li> Centrifugera filterenheterna vid 14.000 xg såsom i 5.1. </li><li> Pipettera 160 l av avjoniserat vatten och centrifugera filterenheterna som i 5.1. Den poolade genomströmning (5.7 och 5,8 steg) innehåller peptider som släpptes av endoproteinas Lys C. </li><li> Överför ultrafiltreringsenheten i ett annat provrör. Tillsätt 40 | ilDB med trypsin (enzym till proteinförhållande 1:100) och blanda vid 600 rpm i termo-blandare under 1 min. Inkubera enheter i en fuktig kammare vid 37 ° C under 4 timmar. Upprepa steg 5,7 och 5,8 för att samla in de tryptiska peptiderna. </li></ol> 6. Kvantifiering av peptiderna <ol><li> Den mätning av halten av peptiden i de proteindigereringar kan utföras i utspädd buffert eftersom tryptofangrupper är väl tillgänglig för lösningsmedlet. </li><li> Pipettera 0,2 ml av ABB i kvartskuvett och registrera emissionsspektrum för &quot;tom&quot;. </li><li> Förbered kalibreringskurvan med 0,1 mikrogram steg genom att lägga till en l alikvoter av TSS till kyvetten och varsam blandning med ABB. </li><li> Rengör kyvetten. </li><li> Pipet provet och registrera spektrum (prov). </li><li> Beräkna av proteinet och peptidkoncentration Sedan 0,1 pg tryptofan motsvarar ca 9 g protein (baserat på den genomsnittliga 1,1% av tryptofan i proteinblandningar som erhållits by lyse mänskliga celler) innehållet i proteinet i provet eller peptidinnehållet i digest är lika: <img alt="Ekvation 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> där F (Standard1) är fluorescensen av 0,1 mikrogram tryptofan standard. Innehållet Peptiden möjliggör beräkning av avkastningen av uppslutning och ger viktig information för att följa peptidfraktionering och masspektrometrisk analys. </li></ol> 7. Fraktionering av Lys-C och tryptiska peptider <ol><li> Späd peptid lösningar erhållna genom digereringar med Lys-C och trypsin med 0,2 ml BRUB pH 11 och pH 5, respektive. </li><li> Montera SAX tip-kolumnen i centrifugrör adapterlocket. </li><li> Tvätta och jämvikta SAX tip-kolonn i följd med 0,1 ml metanol, 0,1 ml 1 M NaOH och 3 gånger med 0,1 ml BRUB, pH 11 för separation av Lys-C Peptides och med BRUB, pH 5 för de tryptiska peptiderna. Flödet av lösningarna genom kolonnen material underlättas genom centrifugering vid 4000 X g. </li><li> Tvätta och jämvikta de C 18 - &#39;StageTips&#39; därefter med, 0,05 ml metanol, sedan med 0,05 ml buffert B med 0,05 ml av Buffert A. Förbered sex C 18 - &#39;StageTips&#39;, 4 för separation av Lys- C-peptider och två för separation av de tryptiska peptider. </li><li> Montera SAX Tip-kolumnen i C 18 - &quot;StageTip&quot;. Fyll provlösningar i ekvilibrerade SAX Tip-kolonner och centrifugera kolumnerna vid 5000 xg under 3 min. </li><li> Jämvikta de &quot;pipett-spets &#39;kolonnerna med 0,1 ml av den BRUB, pH 11 eller pH 5, respektive till Lyc-C och tryptiska prover. Underlätta flödet genom centrifugering vid 5000 X g. </li><li> Överför SAX Tip-kolumn till nästa C 18 - &quot;StageTip&quot;. </li><li> Fortsätt eluering av peptiderna med BRUB pH 6, 4 och 2 för Lys C-provet och med BRUB pH 2 för provet med tryptiska peptider. För varje elueringssteg använda en separat C-18 - &quot;StageTip&quot;. </li><li> Tvätta C 18 - &quot;StageTips&quot; med 0,05 ml av buffert A. </li><li> Eluera fraktioner med 0,05 ml buffert B i små flaskor som används direkt för injicering av prover i LC-systemet, sammanfogade med en masspektrometer. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

Författaren har inget att lämna ut.

Möjligheten att studera FFPE materialet av proteomik teknik till ett djup jämförbar med nukleinsyrasekvensering och microarrayteknik öppnar nya perspektiv i biomarkör och läkemedelsmål upptäckten. Den beskrivna protokollet möjliggör karakterisering och kvantifiering av proteom av populationer av microdissected celler på en skala från 10.000 proteiner. När man använder mindre av microdissected materialet en mindre datamängder kan genereras, men kanske i många fall de kan också ge värdefulla kliniska data. Således kan antingen proverna analyseras direkt efter den MED-FASP förfarandet eller kan separeras i mindre fraktioner. Eftersom FASP förfarande är förenligt med någon typ av proteas, kan andra enzymer eller deras kombination användas från protein digestions 6. Kvaliteten på FFPE materialet verkar vara den mest kritiska frågan i analysen. Vi har upplevt att det fasta vävnaden av samma ursprung, men kommer från skiljerka kliniker hade distinkta egenskaper. Med hjälp av vävnad från en källa vi kunde generera peptider med hög avkastning, medan liknande material från en annan klinik var nästan värdelösa. Det är troligt att den applicerade fixering och inbäddande förfaranden samt lagringsförhållanden är de viktigaste faktorerna som påverkar egenskaperna för den kliniskt material 12. Därför är det lämpligt att testa egenskaperna hos några prover innan du startar ett större projekt. Många publikationer rapporterat användningen av FFPE material i det förflutna. Men antalet av proteiner som identifierats i dessa studier aldrig överskridas mer än 1,000-2,000 proteiner 4. Med tanke på storleken på de humana cellspecifika proteom med mer än 10.000 proteiner, sådana studier kunde bara ge en mycket ytlig bild, nästan begränsad till mycket rikliga proteiner involverade i hushållning funktioner. Vår protokoll möjliggör effektiv isolering av kliniska eller biologiska material from bevarade vävnad och är optimerad för lys, proteinbearbetning och peptid prefraktionering. Som en följd av vår provberedning arbetsflöde, då kopplat till den avancerade masspektrometri, låter insikter i en nästan komplett proteom. Noterbart är detta möjligt i minut krav prov belopp. Den viktigaste fördelen med att använda de bevarade vävnaderna är deras relativa stora tillgänglighet. FFPE prover arkiveras under många år och decennier, och ibland betraktas som värdelösa, nu, tack vare proteomik teknik, verkar som mycket värdefullt material för klinisk forskning. Många sjukdomar kan studeras med hjälp av färsk eller fryst material utredning av FFPE material verkar vara särskilt viktiga för att studera sällsynta sjukdomar 12, var samlingen av ett representativt urval av prov brukar ta lång tid.

Fäst med paraformaldehyd och inbäddning i paraffin (FFPE) är standardmetoden för konservering och pathomorphologic utredning av klinisk vävnadsmaterial. Mikroskopi av den bevarade vävnaden möjliggör identifiering av sjukdomsrelaterade morfologiska förändringar, samt upptäckt och poängsättning av förekomsten av sjukdomsrelaterade antigener. Eftersom oftast bara en liten del av FFPE provet används i dessa analyser, stora mängder av kliniskt material förblir arkiveras och kan utnyttjas i andra typer av studier. Under det senaste decenniet har forskningen inom biovetenskap har stärkts genom den kraftfulla proteomik teknik. Denna teknik möjliggör identifiering och kvantifiering av tusentals proteiner i komplexa proteinblandningar. Ett viktigt särdrag hos tekniken är att endast små mängder av material som behövs för storskalig analyser. Nyligen proteomik studier visat att proteiner kan studeras på en skala från nästan complete proteom 1, 2. Denna typ av undersökningar gör systemomfattande insikter i sammansättningen av de celler och identifiering av grupper av proteiner som förekommer på onormala nivåer i sjukdomar. Dessa studier krävs stor kapacitet masspektrometriska, har den senaste tidens arbete visat att kan uppnås liknande grad av identifiering inom en enda dag av mätning 3. Kravet på en relativt låg provmängd och den breda tillgängligheten av de bevarade kliniska prover frestade oss och andra att utveckla metoder som möjliggör proteomik utforskning av FFPE materialet (för en översikt se 4). Med utnyttjande av reversibilitet formalinfixering under värmebehandling har vi utvecklat ett protokoll som möjliggör kvantitativ extraktion av proteiner från den fasta vävnaden 5. Vi har visat att fixeringen förfarandet bevarar inte bara proteiner, men också åtminstone en del posttranslationella modifieringar. Phosphkan studeras orylation och N-glykosylering hjälp av FFPE proven 5 dock en förutsättning för att det är ett grundligt kontrollerad vävnad insamling, lagring och fixeringsförhållanden. Därefter har vi optimerat metoden för en laser capture microdissection av den fasta vävnaden och för proteomik reaktorbaserade prov behandling 6, 7. En storskalig studie om kolorektal cancer tillåtet kvantitativ analys av 7.500 proteiner från microdissected från kliniskt material 8. Slutligen har vi förbättrat vägen för utforskning av microdissected material genom att tillämpa i rad-två steg proteindigestion protokoll 9. I jämförelse med de gemensamma rötnings strategierna genom enda enzym, möjliggör detta förfarande generation av fler sekvens unika peptider och därmed ger en högre djup av proteinidentifiering. Analys av microdissected mänsklig kolonadenom tillåts proteomik analys till ett djup av 9.500 proteiner per prov 3. I denna study vi kartlagt 55.000 peptider per prov som möjliggör identifiering av 88-89% proteiner med minst 2 peptider. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för beredning av prover från FFPE material för LC-MS/MS analys. Detta protokoll omfattar beredning av vävnadssnitt för microdissection, lys av de isolerade cellerna, och provbehandling i en reaktor-format (FASP) 6. Därefter redovisas en spektrofluorometrisk bestämning av peptidnivåer samt en uppgift med hög prioritet för optimal peptid identifiering av masspektrometri. Slutligen visar vi en stark anjonbytare (SAX) baserad separationsteknik för peptidfraktionering. I denna metod både peptidseparation och slutliga rengöringen utförs med hjälp av pipett-spets mikrokolonner 10, 11. Detta steg är valfritt men rekommenderas i studier där fler än några få mikrogram peptider kan erhållas från ett enda prov. SAX-fraktionering kan avsevärt öka antalet och dynamiskt utbud av identfikationerna och förlänga proteinet sekvenstäckning 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Konserverad kliniskt material är en unik källa för proteomik utredning av mänskliga sjukdomar. Här beskriver vi ett optimerat protokoll som tillåter storskalig kvantitativ analys av formalinfixerade och paraffininbäddade (FFPE) vävnad. Förfarandet innefattar fyra distinkta steg. Den första är att förbereda sektioner från FFPE materialet och microdissection av celler av intresse. I det andra steget de isolerade cellerna lyseras och bearbetas med hjälp av &quot;provberedning filter stödd&quot; (FASP) teknik. I detta steg är proteiner utarmat från reagenser som används för provet lys och smälts i två steg med hjälp av endoproteinas LysC och trypsin. Efter varje spjälkning peptiderna uppsamlades i separata fraktioner och deras innehåll bestäms med användning av en mycket känslig fluorescensmätning. Slutligen är de peptider som fraktioneras på &quot;pipett-tip&quot; mikrokolonner. De LysC-peptider är uppdelade i fyra fraktioner medan tryptiska peptides separeras i två fraktioner. På så sätt framställda prover tillåter analys av proteom från små mängder av materialet till ett djup av 10000-proteiner. Således är den beskrivna arbetsflödet en kraftfull teknik för att studera sjukdomar i ett system-wide-mode och för att identifiera potentiella biomarkörer och läkemedelsmål.

Proteomik analys av FFPE material kräver robusta och reproducerbara metoder för provberedning. I denna skrift visar vi ett protokoll som möjliggör effektiv isolering av cellpopulationer från det fasta materialet och deras kemisk bearbetning resulterar i höga renhetspeptidfraktioner som kan användas direkt för LC-MS/MS analys. Förfarandet består av fyra olika delar: (1) beredning av delar av FFPE prover och dess mikrodissektion, (2) lys av prov och bearbetning av proteinerna med hjälp MED FASP strategi, och (3) kvantifiering och (4) fraktionering av peptider (Figur 1). I det första steget av förfarandet de FFPE proverna sektione med en mikrotom och monterades på membran täckta objektglas. För att öka vidhäftningen mellan de vävnadssnitt och ytan hos glidmembranet är nödvändig för att bestråla glidytan med UV-ljus. För detta ändamål använder vi ljuset av en UV-lampaintegrerad i en cellkultur bänk. Efter detta steg glasen utsätts för tvättningar som medger borttagning av paraffin och rehydratisering av proverna. Det uppblött materialet färgas med hematoxilin för en kort tid. Detta resulterar i en svag färgning av provet men är tillräcklig för visualisering av provområden för mikrodissektion. Färgningsprocessen måste stoppas snabbt genom sköljning av objektglasen med ett överskott av vatten. En långvarig färgning av provresultaten i fattiga peptid avkastning. I nästa steg de torkade sektionerna utsätts för mikrodissektion. Valet av vävnadsområden enskilda celler beror på vilken typ av undersökning och alltid kräver specifika kunskaper i histologi eller pathomorphology. Lasern-utsläppt material samlas på klisterytor provtagningsrören. Eftersom bindningskapaciteten hos det adhesiva materialet är begränsad är det nödvändigt att överföra det microdissected material från locket till than röret efter dissektion av varje 3-5 mm 2 av provet. Detta kan lätt göras genom pipettering av några mikroliter av vävnad lysbuffert (LTB) på locket och ett kort spinning av röret i en centrifug. Efter det att provet uppsamlas i botten av röret, kan fortsätta den mikrodissektion och provsamlingen på locket. När hela provet samlas rören måste dessutom tillsluten med Parafilm och inkuberades i ett vattenbad vid ca 99 ° C under kontinuerlig omrörning under 1 timme. Sedan under inkubationen vatten kondenserar på locket, var 15: e min rören måste vara kort centrifugerades för att samla upp vattnet i röret konen. För att erhålla peptider vävnads lysaten bearbetas med hjälp av MED-FASP strategi. I denna metod de lyserade proteiner utarmas från rengöringsmedel och andra lågmolekylära ämnen, carboamidomethylated vid cysteinylrester, och sedan i följd klövs med två enzymer difFering i spaltnings särdrag: endoproteinas LysC och trypsin. Efter varje digereringssteget peptiderna uppsamlades i separata fraktioner. I denna del av provberedning är det viktigt att fortsätta varje centrifugeringssteg tills mer än 95% av lösningen initialt laddas i filtreringsenheten passerade membranet. Analysera kolonvävnad och dess cancer vi observerat att denna procedur ger 3-6 pg av peptid per 100 nl (100 ug vävnad eller 10 mm 2 av en 10 ^ m sektion) av microdissected materialet (tabell 1). Sedan den extraherbara totalt protein från vävnader är ca 10% av vävnadsvikt extraktions-och uppslutningsförfaranden tillsammans resulterar i en 30 till 60% utbyte i förhållande till den ursprungliga färska vävnaden. Dessa värden återspeglar förluster av proteinet under dehydratisering och färgning mikrodissektion, och bibehållande av den del av det osmält prov med de ultrafiltreringsenheter. Eftersom utvinning och bearbetning av någonn-microdissected FFPE vävnad resulterade i protein-till-peptid-omvandlingsutbyte av 75% 5 är det sannolikt att de kritiska prov förluster uppstår under stegen före MED-FASP. Ett viktigt särdrag hos de peptidblandningar erhållna genom detta förfarande är deras höga renhet, vilket underlättar ytterligare fraktione peptid fraktioneringsprocess och masspektrometri identifiering. Det har nyligen visats genom en analys av kolorektala adenom prover 3. I den studien ledde ca 40% av MS / MS-händelser till identifiering av peptider från FFPE vävnad och ledde kartläggningen av upp till 17.000 peptider per enkel LC-MS/MS körning. Högre identifieringspriser har uppnåtts endast i analyser av fryst in vitro odlade celler 3. I de två sista delarna av hela förfarandet de isolerade peptider kvantifieras och fraktioneras på pipett-tip mikrokolonner. Eftersom mängden av peptid som isolerats från microdissected vävnad är attlåg 10 mikrogram kan inte kvantifieras med hjälp av allmänt använda färgbaserade proteinanalyser. Även de A 280 UV-spektrala mätningar vid dessa koncentrationer är inte användbara på grund av ljusspridningseffekten. Däremot mätningar av fluorescens av de tryptofanrester erbjuda ett pålitligt sätt för bestämning av peptidinnehåll. Vi har nyligen visat att upp till 5.000 proteiner från odlade celler kan identifieras i en &quot;single shot&quot; 4 tim LC-MS/MS Analys 7. Men denna typ av analys tillämpas på inhemska vävnader sällan medger identifiering av mer än 3.000 tusen proteiner. För att öka på djupet i analysen de peptider som genereras i MED FASP måste vara pre-fraktion innan LC-MS/MS. SAX baserad mikrokolonnseparation är en enkel och effektiv fraktioneringsmetod 10. Det har redan tillämpats i flera proteomik studier inklusive de analyserar fast vävnad 5, 8, 9. SAX-&quot;pipett-tip&quot; microcolumns och C 18 - &#39;StageTip&#39; avsaltnings kolumnerna 9 är lätt att tillaga. Kolonnerna monteras genom stapling av pluggar, klippt från SAX eller C 18-membran, i en 200 mikroliter pipettspets 11. Exempel på analysen av SAX-fraktioner FFPE prover visas i tabell 1. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figur 1. Tillvägagångssätt översikt. Förfarandet består av fyra olika delar: (1) beredning av delar av FFPE prover och dess mikrodissektion, (2) lys av prov och bearbetning av proteinerna med hjälp MED FASP strategi, och (3) kvantifiering och (4) fraktionering av peptiderna. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Prov </td><td fo:width="1in"> Prov före fraktionering / rötning </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Masspektrometer som används </td><td fo:width="1.25in"> Peptid avkastning ng / nL prov (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Unika Protein Identifieringar Per enda prov </td><td fo:width=".75in"> Referens </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Normal kolonmukosa </td><td> SAX / ett enzym </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • kolonadenom </td><td> SAX / två enzymer </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6,1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Representativa resultat av proteomic analyser av FFPE microdissected vävnad.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Arkivformalinfixerade och paraffininbäddade (FFPE) kliniska prover är värdefullt material för undersökning av sjukdomar. Här visar vi en provberedning arbetsflöde tillåter djupgående proteomik analys av microdissected FFPE vävnad.

Proteomic Provberedning från formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistokemi: Paraffinsnitt Använda Vectastain ABC Kit från Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Elektrofores separation av proteiner

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxinvapen Induktion och Protein Extraction från Fusarium SPP. Kulturer för proteomik studier

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting: provberedning till Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA-extraktion från paraffininbäddad Material för genetiska och epigenetiska Analyser

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MikroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering för formalinfixerad njurvävnad

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

qPCR är en känslig och snabb metod för detektion av Cytomegaloviral DNA i formalinfixerade, paraffininbäddade Biopsi Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Anställa Digital Droppe PCR för att upptäcka BRAF V600E Mutationer i formalinfixerade paraffininbäddade referensstandard cellinjer

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Framställning av formalinfixerade paraffininbäddade vävnads Cores för både RNA och DNA-extraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...