Name: proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue
Uploaded: 2013-09-02T17:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Yazar metodunu göstermek için sürekli destek ve Bayan Katharina Zettl için teşekkürler Dr Matthias Mann. Bu çalışma Advancement of Science için Max-Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.

1.. Enstrümantasyon Gerekli <ol><li> Mikrodiseksiyon ve örnek liziz doku dilimleri hazırlanması <ol><li> Termoblok 99 ° C ya da kaynar su ile bir banyo için ayarlanır. </li><li> Lazer işletim microdissector (örneğin PALM, Zeiss, Göttingen, Almanya). </li><li> Termostatlı bir tezgah üstü santrifüj, sıcaklık 20 ° C olarak ayarlanmış </li><li> Eppendorf-tipi imha tüpler için bir raf ile ıslak odacık (kutu). </li><li> Kuluçka, 37 ° C&#39;ye ayarlanmış </li><li> Mikro ölçekli kuartz küvetler (0.1-0.2 ml) ile UV ışık yakın heyecanlı floresan ölçülmesini sağlayan spektroflorometre. </li></ol></li></ol> 2. Çözümler <ol><li> &quot;Doku Liziz Tamponu &#39;(TLB): 0.1 M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1 M DTT,% 0.5 (w / v) polietilen glikol 20000 ve% 4 SDS. </li><li> UA çözeltisi: 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5, 8 M üre. 1 numune başına 1 ml hazırlayın. UA ve IAA çözeltiler taze hazırlanmış ve bir gün içinde kullanılmalıdır. </li><li> IAA çözeltisi: 0.05 M iUA odoacetamide. 1 numune başına 0.1 ml hazırlayın. </li><li> Endoproteinaz Lys-C, stok çözelti hazırlayın. </li><li> Tripsin, stok çözüm. </li><li> &#39;Sindirim tampon&#39; (DB): 0.05 M Tris-HCl pH 8.5. 1 numune başına 0.25 ml hazırlayın. </li><li> &#39;Triptofan Standart Çözelti&#39;: 1 mL deiyonize su içinde 0.1 ug triptofan. </li><li> &#39;Tayin tamponu B&#39; (ABB): 10 mM Tris-HCI, pH 7.6. </li><li> Britton ve Robinson Tamponu Universal (Brub) stok çözeltisi. 0.1 M CH3, COOH, 0.1 MH 3 PO 4 ve 0,1 MH 3 BO 3 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın ve gerekli pH, 1 M NaOH ile ayarlanır (2, 4, 5, 6, ve 11). Kullanımdan önce iyonu giderilmiş su ile 5 kat seyreltilir. </li><li> Deiyonize su içinde% 1 (v / v) CH 3 COOH: A Tampon. </li><li> Tampon B:% 60 (v / v) CH3CN,% 1 iyonu giderilmiş su içinde (v / v) CH3COOH. </li></ol> 3. Pipet İpucu ve &#39;StageTip&#39; Sütunlar <ol><li> Bir işbirliği içinde Empore-Anyon zarın 6 kat istifleme tarafından SAX uç-sütun hazırlayınMMON 0.2 ml pipet. Numune başına iki SAX-ucu sütun olun. </li><li> 0.2 ml pipet Empore-C 18 3 kat istifleme tarafından &#39;StageTip&#39; hazırlayın. Her numune için 6 Sahne ipuçları olun. </li></ol> 4. Mikrodiseksiyonu için Doku Dilimleri hazırlanması ve Numune Liziz <ol><li> Bir mikrotom ile kesme bölümleri (dilimlerin kalınlığı örnek bağlıdır. Süresi mikrodiseksiyon 7-10 um dilimleri ile çalışır). </li><li> 45 dakika boyunca UV ışığı ile membran slaytlar (MembraneSlide 1.0 PEN) ışın tedavisi. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C &#39;de ışın zar slaytlar üzerine kuru bölümleri monte edin. </li><li> 2.5 dakika ve 1.5 dakika için ksilen içinde birbirini takip eden iki inkubasyon ile monte edilmiş bölümleri Deparaffinize. Birbirini takip eden mutlak etanol inkubasyon,% 70 etanol ve su, 1 dakika boyunca, her bölümleri ile rehidrate. </li><li> , 20 sn için Mayer&#39;in hematoksilen ile bölümleri Leke 1 dakika ve hava-kuru su ile çalkalayın. </li><li> Hücre Nüfusu toplamaklazer yakalama mikrodiseksiyon sistemini kullanarak ilgi üzerine. PALM cihazı (Zeiss) kullanırken yapışkan harflerle örnekleri (Yapıştırıcı CAP 200) toplamak. </li><li> Kap içinde microdissected malzeme üzerinde TLB bir kısım Pipet. Tüpü kapatın ve kısa bir santrifüj ile süspansiyon toplamak. Lyse 1 saat boyunca çalkalama (600 rpm) ile, bir ısıtma bloğu içinde 99 ° C &#39;de microdissected doku. Microdissected doku 10 nl tamponunun 3 ul kullanın. </li><li> 10 dakika boyunca 18 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de santrifüj ile ham özü açıklığa kavuşturulacaktır. Lizat, -20 ° C&#39;de dondurulmuş saklanabilir </li></ol> 5. Örnek İşleme <ol><li> Çözeltinin az 10 ul filtre kalacak kadar 200 ultrafiltrasyon birimleri UA ul (Adli 30k) ve 14,000 x g santrifüj ile berraklaştırılmış lizat 50 ul kadar karıştırın. Genellikle bu adım, 10-15 dakika santrifüj gerektirir. </li><li> Ultrafiltrasyon birimine UA 200 ul Pipetve 5.1 olarak santrifüj. Toplama tüpü boşaltın. </li><li> Pipet 50 IAA çözeltisi ul ve 5.1 &#39;de olduğu gibi, 1 dakika için santrifüj ve bir termo-mikser içinde 600 rpm&#39;de karıştırın. </li><li> 5.1 &#39;de olduğu gibi ultrafiltrasyon ünitesi ve santrifüj UA 100 ul Pipet. Iki kez bu adımı tekrarlayın </li><li> 5.1 de ultrafiltrasyon ünitesi ve santrifüj DB Pipet 100 ul. Iki kez bu adımı tekrarlayın. </li><li> Yeni toplama tüpleri filtrasyon üniteleri aktarın. Pipet 40 ul endoproteinaz Lys-C (1:100 total protein oranı için proteinaz) ile DB ve 1 dakika için termo-mikser içinde 600 rpm&#39;de karıştırın. 18 saat boyunca 37 ° C&#39;de nemli bir oda içinde birimleri inkübe edin. </li><li> Örneğin 5.1 gibi 14.000 x g&#39;de santrifüj filtre üniteleri. </li><li> 5.1 &#39;de olduğu gibi, deiyonize su ve santrifüj filtre üniteleri Pipet 160 ul. Bir araya toplanan-akış (5.7 ve 5.8 adım) endoproteinaz Lys C tarafından yayımlanan peptidleri içerir </li><li> Yeni bir toplama tüpüne ultrafıltrasyon ünitesi aktarın. 40 ul ekleTripsin (protein oranı 1:100 enzim) ile DB ve 1 dakika için termo-mikser içinde 600 rpm&#39;de karıştırın. 4 saat 37 ° C&#39;de nemli bir oda içinde birimleri inkübe edin. Tekrar triptik peptidler toplamak için 5.7 ve 5.8 adımları. </li></ol> 6. Peptides kantitasyonu <ol><li> Üstünde, triptofan artıklarının çözücüye iyi erişilebilir olduğu için, protein sindirimi peptid içeriği için olan ölçüm seyreltilmiş tamponda gerçekleştirilebilir. </li><li> Kuvars küvete ABB, 0.2 ml pipet ve &#39;boş&#39; için emisyon spektrumunu kaydedebilirsiniz. </li><li> ABB ile küvete ve nazik karışımı TSS 1 ul hacimde ekleyerek 0.1 ug adımları kullanarak kalibrasyon eğrisi hazırlayın. </li><li> Küveti temizleyin. </li><li> Örnek Pipet ve spektrumu (örnek) kaydedebilirsiniz. </li><li> , Protein ve peptid konsantrasyonu hesaplamak 0.1 ug protein, triptofan b edilen karışımlarda triptofan içeriği ortalama% 1.1 &#39;göre yaklaşık 9 ug protein (karşılık gelen yanay) insan hücreleri lize protein içeriği özetle örnek veya peptit içeriği eşittir: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> F (normu1) 0.1 ug triptofan standart floresan olduğu. Peptid içeriği sindirim prosedürünün verim hesaplanmasını mümkün kılacak ve peptit fraksiyonasyon ve kütle spektrometrik analizi aşağıdaki için gerekli bilgileri sağlar. </li></ol> 7. Lys-C ve Triptik peptidlerin Fraksiyonu <ol><li> Sırasıyla Brub pH 11 ve pH 5, 0.2 ml, ile, Lys-C ve tripsin ile sindirimler ile elde edilen peptid çözüm seyreltin. </li><li> Santrifüj tüp adaptörü kapağı SAX ucu-sütun birleştirin. </li><li> Brub, Lys-C peptidleri ayrılması için pH 0.1 11 ml metanol, 0.1 ml ile arka arkaya 1 M NaOH, 0.1 ml, ve 3 kez SAX ucu sütun yıkayın ve dengeledes ve Brub, triptik peptidler için pH 5,. Sütun malzemeden geçen solüsyonların akış 4000 x g santrifüjleme ile kolaylaştırılır. </li><li> Ve Lys-ayrılması için 4; &#39;StageTips&#39; - Yıkama ve C18 denge - daha sonra daha sonra &#39;ile StageTips&#39;, metanol, 0.05 ml Tampon B ile 0.05 ml ve Tampon A içinde 0.05 ml altı C 18 ile hazırlayın C peptidler ve triptik peptidlerin ayrılması için iki. </li><li> &#39;StageTip&#39; - C 18&#39;de SAX İpucu-sütun birleştirin. Dengelenmiş SAX İpucu-sütunlar halinde örnek çözümler yerleştirin ve 3 dakika boyunca 5.000 xg&#39;de sütunları santrifüj. </li><li> 0,1 sırasıyla Lyc-C Brub ml, pH 11 ya da pH 5 ve triptik örnekleri ile &#39;pipet ucu&#39; sütun dengelenmesi. 5000 x g santrifüjleme ile akışını kolaylaştırmak. </li><li> Bir sonraki C 18 SAX Tip-sütun transfer - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Lys C ve örnek için BRU ile Brub pH 6, 4 ve 2 ile peptidlerin yıkama devamTriptik peptitler ile örnek için B pH 2. &#39;StageTip&#39; - Her yıkama adımı ayrı bir C 18 kullanın. </li><li> Tampon A içinde 0.05 ml &#39;StageTips&#39; - C18 yıkayın </li><li> Bir kütle spektrometresi ile monte LC sistemi içine enjeksiyon için numunelerin doğrudan kullanılan şişelere Tampon B içinde 0,05 ml fraksiyonlar elue. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaraj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+proteome+and+transcriptome+mapping+of+a+human+cancer+cell+line.">Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 548 (2011).</li><li>Beck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteome+of+a+human+cell+line.">The quantitative proteome of a human cell line.</a> Molecular systems biology. 7, 549 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

Yazar ifşa hiçbir şey vardır.

, Nükleik asit sekanslama ve mikrodizi teknikleri ile karşılaştırılabilir bir derinliğe proteomik teknolojisi ile FFPE malzeme çalışma yeteneği biyomarker ve ilaç hedefi tespiti yeni ufuklar açabilir. Açıklanan protokol karakterizasyonu ve 10000 protein bir ölçekte microdissected hücre popülasyonlarının proteomlarda miktarını ölçülebilir sağlar. Microdissected malzemenin daha az kullanıldığında daha küçük bir veri setleri üretilebilir, ancak belki de bir çok durumda, aynı zamanda, bu önemli klinik veriler sağlayabilir. Bu nedenle, numuneler ya MED-FASP işleminden sonra direkt olarak analiz edilebilir veya daha fraksiyonlarda ayrılabilir. FASP prosedür proteaz herhangi bir türü ile uyumlu olduğundan, diğer enzimler ya da bunların kombinasyonu protein sindirimler 6&#39;dan kullanılabilir. FFPE malzeme kalitesi analizi en kritik bir konu olduğu görülmektedir. Biz sabit aynı kökenli doku ama gelen farklı olduğunu yaşadımKBB klinikleri farklı özellikleri vardı. Başka bir klinikte benzer malzemenin neredeyse işe yaramaz iken, biz yüksek verimde peptitler oluşturmak başardık tek bir kaynaktan doku kullanma. Bu fiksasyon uygulanır ve gömme işlemleri hem de depolama koşulları klinik malzeme 12&#39;nin özelliklerini etkileyen önemli faktörler olduğu muhtemeldir. Bu nedenle, daha büyük bir başlatmadan önce birkaç örnek özelliklerini test etmek için tavsiye edilir. Birçok yayın geçmişte FFPE malzeme kullanımını rapor etmiştir. Bununla birlikte, bu çalışmalarda tanımlanan proteinlerin sayısının fazla 1,000-2,000 proteinleri 4 geçmemiştir. 10.000 &#39;den fazla protein ihtiva eden insan hücre spesifik proteomlarda büyüklüğü göz önüne alındığında, bu tür çalışmalar, hemen hemen temizlik işlevleri dahil çok fazla proteinler ile sınırlı çok yüzeysel bir resim sağlamak için sadece mümkün. Bizim protokol klinik veya biyolojik madde f etkili izolasyonunu sağlayanrom doku korunmuş ve parçalama, protein işleme ve peptid prefractionation için optimize edilmiştir. Sonuç olarak bizim örnek hazırlama, iş akışı, high-end kütle spektrometresi ile birleştiğinde, neredeyse tam bir proteomlarda içgörüler verir. Kayda değer, bu dakika Numune miktarı gereksinimleri mümkündür. Korunmuş dokuların kullanmanın büyük avantajı kendi göreceli geniş yer olduğunu. FFPE örnekleri yıllar ve on yıllar boyunca arşivlenir ve bazen yararsız kabul, şimdi, proteomik teknoloji sayesinde, klinik araştırmalar için de son derece değerli malzeme görünür. Birçok hastalık FFPE malzemenin taze veya dondurulmuş malzeme soruşturma kullanılarak incelenebilir Oysa nadir hastalıklar 12 araştırılması için özellikle önemli gibi görünüyor, örnek bir temsilcisi kümesi genellikle uzun bir zaman alıyor koleksiyonu vardı.

Paraformaldehitle Tespit ve parafin (FFPE) gömme korunması ve klinik doku malzeme pathomorphologic soruşturma için standart bir yöntemdir. Korunmuş doku Mikroskopi hastalığı ile ilgili morfolojik değişikliklerin belirlenmesi ve hastalık ile ilgili antijenlerin meydana algılanmasını ve puanlama sağlar. FFPE örnek genellikle sadece küçük bir kısmı bu analizlerde kullanılan olduğundan, klinik malzemenin büyük miktarlarda arşivlenmiş kalır ve çalışmalar, diğer türleri de yararlanılabilir. Son on yılda yaşam bilimleri araştırma güçlü proteomik teknolojisi ile güçlendirilmiştir. Bu teknoloji sağlayan karmaşık bir protein karışımları içinde binlerce proteinin tanımlanması ve kantitatif. Teknolojisinin önemli bir özelliği, büyük ölçekli analizleri için malzeme, sadece az miktardaki gerekli olmasıdır. Son çalışmalar, proteomik proteinler yaklaşık comp bir ölçekte incelenebilir göstermiştirlete 1, 2 Proteomlar. Araştırmaların Bu tür hücrelerin kompozisyon ve hastalıklarda anormal seviyelerinde meydana gelen proteinlerin gruplarının tanımlanmasında sistem geniş bir bakış açısı sağlar. Bu çalışmaların büyük bir kütle spektrometresi kapasitelerini gerekli ise, son iş kimlik benzer ölçüde ölçümü 3 tek bir gün içinde elde edilebileceğini göstermiştir. Nispeten düşük örnek miktarının ihtiyacı ve korunmuş klinik örneklerin geniş yer FFPE malzemenin proteomik keşif (bir yorum 4 görmek için) sağlayan yöntemler geliştirmek için bize ve başkalarına cazip. Biz sabit doku 5 proteinlerin kantitatif çıkarma sağlayan bir protokol geliştirdik bir ısı tedavi altına formalin fiksasyon reversibilitesi yararlanarak. Sabitlemek için prosedür proteinleri değil, aynı zamanda en azından bir dönüşüm sonrası modifikasyonlar, sadece muhafaza göstermiştir. Phosphorylation ve N-glikosilasyon ancak FFPE örnekleri 5, bu iyice kontrollü doku toplama, depolama ve tespit koşulları olan bir ön kullanılarak incelenebilir. Sonra, sabit bir doku lazer yakalama mikrodiseksiyon ve proteomik reaktör merkezli örnek işleme 6, 7 yöntemini optimize ettik. Kolorektal kanseri üzerinde büyük ölçekli bir çalışmada klinik malzeme 8 microdissected 7.500 proteinlerin kantitatif analiz izin. Son olarak, üst üste iki adım protein sindirimi protokolünü 9 uygulayarak microdissected malzeme keşif yolu düzeldi. Tek bir enzim ile sindirim ortak stratejileri ile karşılaştırıldığında, bu prosedür daha sekansa özgü peptidlerin nesil sağlar ve dolayısıyla, protein tanımlama daha yüksek bir derinlik ile sonuçlanır. Microdissected insan kolon adenom analizi örnek 3 başına 9500 proteinlerin derinliğe kadar proteomik analiz izin verdi. Bu saplamaen az 2 peptidleri ile 88-89% proteinlerin tanımlanmasına izin veren numune başına 55,000 peptidler eşleştirilir y. Burada LC-MS/MS analizi için FFPE malzemeden numunelerin hazırlanması için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Bu protokol bir reaktör biçimi (FASP) in Mikrodiseksiyon için doku dilimleri hazırlanması, izole edilmiş hücrelerin parçalanma ve numune işleme oluşur 6. Sonra peptid verimleri bir spektroflometrik belirlenmesini açıklamak; optimum peptid tanımlanması için yüksek öneme sahip bir görev kütle spektrometresi ile. Son olarak, güçlü anyon değiştirici (SAX) esaslı peptid paya ayırma için ayırma tekniği göstermektedir. Bu yöntemde, peptid ayrılması ve son temizleme hem de pipet ucu microcolumns 10, 11 kullanılarak yapılmaktadır. Bu adım, isteğe bağlı, ancak daha az mikrogram fazla peptitler tek numuneden elde edilebileceği çalışmalarda önerilir. SAX-fraksiyon ölçüde ident sayısını ve dinamik aralığı artırabilirifications ve protein dizisi kapsama 3, 10 uzanır.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Korunan klinik malzeme insan bozuklukları proteomik soruşturma için eşsiz bir kaynaktır. Burada formalin büyük ölçekli kantitatif analiz sabit ve parafin (FFPE) doku sağlayan optimize edilmiş bir protokol açıklar. Prosedür, dört ayrı adımları içerir. Birincisi FFPE malzeme ve ilgi duyulan hücrelerin mikro-kesim gelen bölümlerinin hazırlanmasıdır. İkinci aşamada izole edilmiş hücreler lize edildi ve &#39;filtre destekli numune hazırlama&#39; (FASP) tekniği kullanılarak işlenir. Bu aşamada, protein numune lisis için kullanılan tepkin maddeler tükenmiş ve endoproteinaz lysC ve tripsin kullanılarak iki adımda sindirilir. Her bir sindirimden sonra, peptidler ayrı fraksiyonlar halinde toplanır ve bunların içeriği son derece hassas bir floresan ölçümü ile belirlenir. Son olarak, peptidler &#39;pipet ucu&#39; microcolumns üzerinde fraksiyone edilmiştir. LysC-peptidler ise 4 bölüme ayrılır triptik peptides 2 bölüme ayrılmıştır. Bu şekilde hazırlanan numuneler 10000 protein derinliğe kadar malzeme az miktarda ikinci proteomlarda analizini sağlar. Bu durumda, tarif edilen olası biyolojik akışı ve ilaç hedefleri tespit edilmesi için de bir sistem geniş bir şekilde hastalıkların çalışmak için güçlü bir tekniktir.

FFPE malzeme proteomik analizi numune hazırlama için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemleri gerektirir. Bu yayında etkili sabit malzemeden hücre popülasyonlarının izole edilmesini ve doğrudan LC-MS/MS analizi için kullanılabilecek yüksek saflıkta elde edilen peptit parçaları olarak kimyasal işleme izin veren bir protokol göstermektedir. FFPE örnekler ve mikro-kesim, MED FASP yaklaşımı kullanılarak proteinlerin örnek ve işleme (2) liziz, ve (3) miktarının ve (4) damıtımı bölümlerinin (1) hazırlanması: Prosedür, dört ayrı bölümden oluşur peptidler (Şekil 1). Prosedürün ilk aşamasında FFPE numuneler bir mikrotom ile kesitli ve zar kaplı slaytlar üzerine monte edilmiştir. Doku bölümleri ve slayt zarın yüzeyi arasındaki yapışmayı arttırmak için, UV ışığı ile kayıcı yüzey ışın tedavisi için gereklidir. Bu amaçla, bir UV lambasının ışık kullanımıBir hücre kültürü tezgah entegre. Bu aşamadan sonra slaytlar örneklerin parafin ve rehidrasyon çıkarılmasını sağlayan yıkama tabi tutulur. Rehidrate madde, kısa bir süre için hematoksilin ile boyandı. Bu numunenin bir zayıf lekelenme ile sonuçlanır, ancak mikro-kesim için örnek alanlar görselleştirilmesi için yeterlidir. Boyama işlemi, su fazlası ile slaytları durulama ile hızla durdurulmalıdır. Fakir peptid getirilerindeki numune sonuçlarının bir uzun süreli boyama. Bir sonraki adımda, kuru bölümler mikrodiseksiyon tabi tutulur. Tek tek hücrelerin doku alanlarının seçimi soruşturma türüne bağlıdır ve her zaman histoloji veya pathomorphology özel bilgi gerektirir. Lazer yayımlanan malzeme, numune toplama tüpleri yapışkan yüzeyleri üzerinde toplanır. Yapışkan malzemenin bağlama kapasitesi sınırlı olduğu için t kapak arasındaki microdissected malzeme transferi için gerekli olanörneğin her 3-5 mm 2 diseksiyonu sonra o tüpü. Bu kolayca, kapak ve bir santrifüj tüpünün kısa bir iplik üzerine doku liziz tamponu (LTB) birkaç mikrolitre pipetleme ile yapılabilir. Numune, tüpün alt toplanan sonra kapak üzerindeki mikrodiseksiyon ve numune toplama devam edilebilir. Bütün numune toplanmaktadır sonra tüpler, ek olarak 1 saat boyunca sürekli ajitasyon ile 99 ° C &#39;de Parafilm ile kapatılır ve bir su banyosu içinde inkübe olması gerekir. İnkübasyon sırasında, su kapak üzerinde yoğunlaşır için, her 15 dakikada bir kısa bir süre tüpler tüp koni içindeki suyu geri toplamak için santrifüj gerekir. Peptidler elde etmek için doku lizatları, MED-FASP yaklaşımı kullanılarak işlenir. Bu yöntemde, lize edilmiş proteinler sisteinil kalıntılarında carboamidomethylated deterjan ve diğer düşük molekül ağırlıklı maddelerden tükenmiş ve daha sonra art arda, iki enzim ile sindirilmiş difbunların parçalanma Özelliklerdeki fering: lysC ve tripsin endoproteinaz. Her sindirim aşamasından sonra peptidler ayrı fraksiyonlar halinde toplanır. Numune hazırlama bu bölümünde, başlangıçta zar geçirilen filtrasyon ünitesi yüklenen çözeltisinin fazla% 95 kadar santrifüj adımları her devam etmek önemlidir. Kolon doku ve kanser analiz biz bu yöntemin verimi 100 nl microdissected madde (Tablo 1) (100 ug, doku ya da bir 10 um kesiti 10 mm2) başına peptidin 3-6 ug. Dokulardan ekstre total protein ekstraksiyonu ve sindirim işlemleri birlikte orjinal taze dokuya ilgili olarak bir% 30-60 verimle sonuçlanan doku ağırlığının yaklaşık% 10 olduğu. Bu değerler, dehidrasyon ve boyama, mikro-kesim ve ultrafiltrasyon birimleri sindirilmemiş numunenin kısmının tutma sırasında proteinin kayıplarını göstermektedir. Çünkü hiçbir çıkarma ve işlemen-microdissected FFPE doku bu kritik örnek kayıpları MED-FASP önce tüm adımları sırasında meydana olasıdır 75,% 5 protein-to-peptid-dönüşüm verimi ile sonuçlanmıştır. Bu prosedür ile elde edilen peptid karışımlarının önemli bir özelliği, bundan başka ayırma peptid ayırma işlemi ve kütle spektrometrisi tanımlanmasını kolaylaştıran yüksek saflıkta. Yakın zamanda, kolorektal adenoma örnekleri 3 analizi ile gösterilmiştir. Bu çalışmada, MS / MS ve etkinlikleri yaklaşık% 40 FFPE dokudan peptidlerin belirlenmesine yol açmıştır ve bir LC-MS/MS çalışma başına kadar 17000 peptidler haritalama ile sonuçlanmıştır. Daha yüksek oranlar tanımlama sadece donmuş in vitro kültürlenmiş hücrelerin 3 analizinde elde edilmiştir. Bütün prosedürün son iki bölgelerinde izole peptidler nicelendirilir ve pipet ucu microcolumns göre parçalara ayrılmış. Microdissected dokusundan izole peptidin miktarlarda olmak olduğuDüşük 10 ug bunlar yaygın olarak kullanılan boya bazlı protein tahlilleri kullanılarak sayısal olamaz. Ayrıca bu konsantrasyonlarda A 280 UV-spektral ölçümler sayesinde ışık saçma etkisi yararlı değildir. Bunun aksine, triptofan artıklarının floresans ölçümleri peptit içeriğinin belirlenmesi için güvenilir bir yol sunar. Son zamanlarda kültürlenmiş hücrelerden 5000 proteinler, &#39;tek bir atış&#39; 4 saat LC-MS/MS analizi 7 tespit edilebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte bu tip analiz nadiren 3.000 &#39;den fazla bin proteinlerin tespiti sağlar: yerli dokulara uygulanır. MED FASP üretilen peptitler LC-MS/MS önce ön parçalandı gereken analizin derinliğinin arttırmak. SAX tabanlı mikro kolon ayırma basit ve verimli bir ayrıştırma yöntemi 10 olduğunu. Zaten sabit doku 5, 8, 9 analiz de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalarda proteomik uygulanmıştır. SAX-&#39;pipet ucu&#39; microcoluMNS ve C 18 - &#39;StageTip&#39; tuz giderme sütun 9 hazırlanması kolaydır. Sütunlar, fişlerin istifleme ile monte SAX kesmek veya C 18 membranlar, 200 ul pipet 11 edilmektedir. SAX-parçalandı FFPE numunelerin analizi örnekleri, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Şekil 1. Prosedür genel bakış. FFPE örnekler ve mikro-kesim, MED FASP yaklaşımı kullanılarak proteinlerin örnek ve işleme (2) liziz, ve (3) miktarının ve (4) damıtımı bölümlerinin (1) hazırlanması: Prosedür, dört ayrı bölümden oluşur peptidler. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Örnek </td><td fo:width="1in"> Örnek ön ayırma / sindirim </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> El Kütle spektrometresi </td><td fo:width="1.25in"> Peptit verim ng / nL örnek (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Tek bir örnek Başına benzersiz Protein Tanımları </td><td fo:width=".75in"> Referans </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • Normal kolon mukozası </td><td> SAX / bir enzimi </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8), 30 ± 8 (n = 8), </td><td> 5985 ± 54 5.868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • Kolon Adenom </td><td> SAX / iki enzimler </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6.1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. FFPE microdissected doku proteomik analiz temsil edici sonuçları.

Watch this Scientific Journal Video about Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue at JoVE.com

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Arşiv formalin sabit ve (FFPE) gömülü parafin klinik numuneleri hastalıkların araştırılması için değerli bir malzemedir. Burada microdissected FFPE doku derinlemesine proteomik analizini sağlayan bir örnek hazırlama iş akışını göstermektedir.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Research

JoVE Journal

Biology

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Formalin Sabit Böbrek Dokular Hibridizasyon

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...