Name: transplantation of olfactory ensheathing cells to evaluate functional recovery after peripheral nerve injury
Uploaded: 2014-02-23T16:00:00
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Die Autoren möchten ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants respiratoires) und Fondation de l&#39;Avenir für ihre finanzielle Unterstützung und Dr. Fanie Barnabé-Heider für die Bearbeitung des Manuskripts bestätigen.

1. Primärkulturen von Riechschleimhaut und Riechkolben <ol><li> Vor der Präparation <ol><li> Machen Medium, 50 ml, durch Zugabe von 44 ml einer kalziumfreien Dulbeccos modifiziertem Eagle-/ Ham &#39;s F12-Medium (DMEM/F12) mit 5 ml fötalem Rinderserum (FBS) und 1 ml Penicillin / Streptomycin ergänzt. </li><li> Mantel 75 cm 2-Kolben mit Poly-L-Lysin (50 ug / ml, 1,5 &amp;mgr; g / cm 2), 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie Flaschen mit PBS 1x. </li><li> Lagern Sie die Flaschen be...

<ol>
	<li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+of+olfactory+ensheathing+cells+from+olfactory+bulb+and+olfactory+mucosa.">Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa.</a> Glia. 58, 1570-1580 (1002).</li><li>Honore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+genetic+profiling+of+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+from+the+olfactory+bulb.">Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb.</a> Glia. 60, 404-413 (2012).</li><li>Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+glia:+their+contribution+to+primary+olfactory+nervous+system+regeneration+and+their+regenerative+potential+following+transplantation+into+the+injured+spinal+cord.">Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.</a> Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).</li><li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes.">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li><li>Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+olfactory+ensheathing+cells+express+nerve+growth+factor,+brain-derived+neurotrophic+factor,+glia+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+their+receptors.">Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).</li><li>Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+nodal+formation+of+regenerated+peripheral+nerve+fibers+following+transplantation+of+acutely+prepared+olfactory+ensheathing+cells.">Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells.</a> Brain Res. 1125, 1-8 (2006).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+promotes+axonal+regeneration+and+functional+recovery+of+peripheral+nerve+lesion+in+rats.">Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats.</a> Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).</li><li>Guntinas-Lichius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+stimulates+the+collateral+sprouting+from+axotomized+adult+rat+facial+motoneurons.">Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons.</a> Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).</li><li>Makoukji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+enhances+remyelination+of+peripheral+nerves.">Lithium enhances remyelination of peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+mucosa+and+bulb+origin+enhances+functional+recovery+after+peripheral+nerve+lesion.">Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion.</a> PloS one. 6, 22816 (2011).</li><li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells.">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li><li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans.">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb.">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration,+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section/resection+model.">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li></ol>

Die hier vorgestellten Techniken machen OECs ein nützliches Modell, um Zelltransplantationen in peripheren Nervenverletzung Modelle zu studieren. Das Zellkulturverfahren ist relativ einfach und leicht durchgeführt werden. Auf der anderen Seite, chirurgische Eingriffe, insbesondere Abschnitt / Anastomose der RLN, erfordern Erfahrung und muss von qualifiziertem Fachpersonal durchgeführt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren markieren wichtige Faktoren zu konzentrieren, um ...

Die Riechschleimhaut (OM) in peripheren Nervensystems und des olfaktorischen Bulbus (OB) in das zentrale Nervensystem, die primäre olfaktorische System besteht aus zwei unterschiedlichen Teilen zusammengesetzt. Der primäre olfaktorische System wird durch die Kapazität der primären olfaktorischen Neuronen (PON) zur Selbsterneuerung während des gesamten Lebens in Säugetierarten gekennzeichnet. Diese Fähigkeit wird durch die Anwesenheit von neuralen Stammzellen in dem OM ermöglicht. PON Wachstum und Nachwachsen von OM zu OB wird von spezialisierten Gliazellen genannt ensheathing Riechzellen (OECs) erleichtert. OECs sind Neuralleistenzellen, die einen günstigen Mikroumgebung für die Neurogenese des PON von OM in den OB 1 erstellen. Dadurch kann OECs in OM und OB bilden unterschiedliche Subpopulationen von Zellen 2,3 gefunden werden. Die unterschiedlichen Eigenschaften der OECs haben Wissenschaftler führen, um sie für die Zelltransplantationen in mehreren Nervensystem Läsion Paradigmen 4 zu verwenden. Tatsächlich OECs produzieren Wachstumsfaktoren, Glia-Narben zu reduzieren, prOmote axonalen Nachwachsen und kann frei vermischen sich mit 5,6 Astrozyten. Allerdings sind die überwiegende Mehrheit dieser Studien zu Rückenmarksverletzungen (SCI) basiert; wenige von ihnen haben OECs nach peripherer Nervenverletzung (PNI) 7,8 verwendet. Obwohl das periphere Nervensystem hat eine große Kapazität, nach Nervenverletzung zu regenerieren, komplette Abschnitte induzieren abweichenden axonalen Nachwachsen. In der Tat, nach der vollständigen Querschnitten erhalten des Gesichts oder der wiederkehrenden Kehlkopfnerven (RLN) fehlgeleitet Axone verursachen Muskelkokontraktionen Synkinese genannt. Deshalb ist es von grundlegender Bedeutung, um ein Modell der PNI schlagen nicht nur quantitativ axonale Nachwachsen sondern auch die Wirksamkeit der Muskelkontraktionen zu bewerten. In der Literatur wird beschrieben häufigste Modell ist auf Gesichtsnerv Läsion 9,10 basiert. In diesem Modell werden funktionelle Auswertungen auf die Erholung der Whisker Wanderung 10 basiert. Es ist jedoch schwierig, die Effizienz des beweglichen demonstrierenements und die Muskelkokontraktionen Phänomene zu unterscheiden. Wir schlagen vor, hier ein Modell auf der Basis einer RLN Läsion. Dieses Modell ermöglicht die Auswertung der nicht nur das Nachwachsen der axonalen und Bewegungen der Stimmbänder, sondern auch die Effizienz und Funktionalität dieser Bewegungen nach Zelltransplantationen 11,12. Dieses Protokoll bietet eine Schritt für Schritt vor, um Kultur-und Transplantations OECs von OM und OB in einem Abschnitt RLN / Anastomose Modell und zu den Tieren nach der Operation zu beurteilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">E3521T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E3387M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1152-8876</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3467Y</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3513P</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03256.0100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DDSA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00563-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MNA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00886-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDMA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00141-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">POLYBED 812</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>08791-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-mouse&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>550589</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel GFR</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti P75</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB 365</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11.0 Wire</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>FG 2881</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Toluidine Blue&#160;</td>
			<td>RAL DIAGNOSTICS</td>
			<td>361590-0025</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Sigma 2-16PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td>Faster</td>
			<td style="width:197px;">BH-EN 2003 S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>FACSCalibur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Videolaryngoscope</td>
			<td>Karl Storz Endoskope</td>
			<td>Telecam SL NLSC 20212120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition system</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Powerlab system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramitome Ultramicrotomy System&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Leica</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis system</td>
			<td>Explora Nova</td>
			<td>Mercator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of olfactory ensheathing cells to evaluate functional recovery after peripheral nerve injury

<html> Riech ensheathing Zellen (OECs) sind Neuralleistenzellen, die das Wachstum und das Nachwachsen der primären Riechzellen zu ermöglichen. Tatsächlich wird die primäre olfaktorische System durch seine Fähigkeit, sich neue Neuronen auch bei erwachsenen Tieren zu geben ist. Diese besondere Fähigkeit ist teilweise auf die Anwesenheit von OECs die eine günstige Mikroumgebung für die Neurogenese zu erstellen. Diese Eigenschaft der OECs hat für Mobil Transplantation wie in Rückenmarksverletzung Modelle verwendet. Obwohl das periphere Nervensystem hat eine größere Kapazität nach Nervenverletzung als das zentrale Nervensystem zu regenerieren, komplette Abschnitte induzieren Fehlleitung während der axonalen Nachwachsen insbesondere nach Gesichts von Kehlkopfnervendurchtrennung. Insbesondere voller Schnitte des N. recurrens (RLN) induziert abweichenden axonalen Nachwachsen was Synkinese der Stimmbänder. In diesem speziellen Modell haben wir gezeigt, dass OECs Transplantation effizient axonalen Nachwachsen erhöht. ve_content &quot;&gt; OECs aus sowohl in der Riechschleimhaut (OM-OECs) und Riechkolben (OB-OECs) weisen mehrere Subpopulationen gebildet. Wir stellen hier ein Modell der zellulären Transplantation auf Basis der Verwendung dieser verschiedenen Subpopulationen von OECs in eine RLN Verletzungsmodell. Mit diesem Paradigma wurden Primärkulturen von OB-OECs und OM-OECs in Matrigel nach Schnitt und Anastomose der RLN transplantiert. Zwei Monate nach der Operation, werteten wir transplantierten Tieren durch komplementäre Analysen auf der Basis videolaryngoscopy, Elektromyographie (EMG) und histologische Untersuchungen. Erstens erlaubt videolaryngoscopy uns Kehlkopffunktionen auszuwerten, insbesondere Muskelkokontraktionen Phänomene. Dann analysiert EMG gezeigt Reichtum und Synchronisation von Muskelaktivitäten. Schließlich histologische Studien basierend auf Toluidinblau-Färbung erlaubt die Quantifizierung der Anzahl und Profil von markhaltigen Fasern. Alle zusammen, beschreiben wir hier, wie Sie, Kultur, ide isolierenntify und Transplantation OECs von OM und OB nach Abschnitt RLN-Anastomose und wie zu bewerten und zu analysieren, die Effizienz der transplantierten Zellen auf das Nachwachsen der axonalen und Kehlkopffunktionen.

Abbildungen mit Steuerung und reinnervierte (Abschnitt / anastomosiert) Tiere wurden ausgewählt, als Ergebnisse können in Abhängigkeit von der Zelltransplantationen durchgeführt (OM, OB oder OM + OB) variieren. Zellkultur Die Zellen anhaften schnell auf der Kunststoffoberfläche und wurde in parallelen Schwaden von Zellen, die länglich oder verjüngt, dreieckig, mehrpolige oder spindelförmig getrennt sind (Fig. 1A und 1B). Nach 8 Tagen <e...

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Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Riech ensheathing Zellen (OECs) sind Neuralleistenzellen, die das Wachstum der primären Riechzellen zu ermöglichen. Diese spezielle Eigenschaft kann für die zelluläre Transplantation verwendet werden. Wir stellen hier ein Modell der zellulären Transplantation basierend auf der Verwendung von OECs in einer Kehlkopfnervenschädigung-Modell.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

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Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

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