وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة لDJB (AI041930، AI073142، AI075931، AI091461 و).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

ونحن هنا نقدم بروتوكول لجينة فعالة تستهدف في Δ ku80 سلالات طفيلي لتمكين استرداد فعالة من ذرية التلاعب بها وراثيا التي تمتلك الحذف استهداف الجينات، واستبدال الجين، و / أو الجينات الموسومة. تنفيذ متسلسلة من هذه الأساليب يوفر نهجا موثوق بها لعزل المسوخ طفيلي التي تحتوي على التلاعب الجيني المستهدفة واحد أو عدة 1-3. في حين أن الجيل من حذف استهدفت يعتمد على عوامل متعددة، استخدام Δ ku80 سلالة مع الاستراتيجية المقدمة وبروتوكول يزيد بشكل كبير من كفاءة وسهولة صنع سلالات متحولة محددة بدقة من T. المقوسة للدراسات الجينية وظيفية. جينوم T. وفرداني المقوسة خلال مراحل اللاجنسي. وبالتالي النظر إلى جعل عند التخطيط لحذف الجين هو أن هذا الجين لا يجب أن يكون أساسيا في المختبر. ومع ذلك، فإن كفاءة targeتينغ بالضربة القاضية جين في Δ ku80 سلالات عالية جدا، وهذا يتيح للعزل سلالات متحولة مع معدلات تكرار ضعاف بشكل ملحوظ. إذا كان الجين المستهدف هو ضروري، والطفيليات غالبا ما تتوقف لتكرار أثناء الاختيار. آخر عاملا حاسما في التلاعب الجيني المستهدف هو أن التماثل الكمال مع ما لا يقل عن 620 شركة بريتيش بتروليوم من الجهة استهداف الجيني هو مطلوب للحصول على التكاملات كشف استهدفت 2. المناطق أطول من التماثل إنتاج كفاءات أعلى من الاستهداف وباستخدام استهداف الأجنحة الحمض النووي من حوالي 1،000 سنة مضت هو نهج موثوقة وفعالة 1-4. لهذا السبب من المهم أن يتم إنشاء الأجنحة استهداف الجيني من نفس السلالة من T. المقوسة (RH، PRU) لان السلالة التي يتم التلاعب بها وراثيا. عدم تناظر كافية يمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان في التكامل استهدفت واحدة من الجينوم الجهة الاستهداف، ولكن ليس غيرها. التكامل ناقصة أو عدم الحصول على ماجستير خروج المغلوبY يكون أيضا بسبب استمرار episomal. مباشرة بعد ترنسفكأيشن، يتم nonintegrated كل من الجزيئات التي تستهدف episomes، وأحيانا تستهدف الجزيئات يمكن أن تستمر كما episomes لأجيال عديدة. باستخدام الأجنحة DNA الهدف من ~ 1 KBP والاستمرار في تمرير الطفيليات تحت الاختيار قبل إعادة subcloning كثيرا ما يحل المشاكل المرتبطة استمرار episomal. بمجرد التحقق من صحة بالضربة القاضية ويتم إزالة علامة HXGPRT، ويمكن تكرار هذه الاستراتيجية تستهدف الجين على الحكومة العراقية الثانية لتوليد متعددة الحذف الجينات في سلالة الطفيلي واحدة 1-3. ويمكن أيضا توليد الحذف، واستبدال، أو الجينات الموسومة إنجازه باستخدام علامات اختيار مختلفة (بليوميسين، CAT، بيريميثامين مقاومة DHFR، الخ). على الرغم من أن علامة اختيار CAT موجود في النوع الثاني Δ ku80 PRU الجينوم 1 حاليا، يمكن إزالة هذه العلامة باستخدام HXGPRT </EM&gt; بروتوكول اختيار صفها هنا. في أيدينا، HXGPRT الاختيار هو الأكثر أمانا والأكثر كفاءة مع علامة أعلى كفاءة الاستهداف حيث A-نسخة واحدة الإدراج المستهدف هو كاف لاختيار القوي في MPA + X المتوسطة. HXGPRT يوفر أيضا النهج الوحيد المفيد حاليا للحذف المستهدفة من علامة اختيار (الشكل 3) باستخدام 6 thioxanthine (6TX) اختيار 2،3. وهكذا يوفر هذا البروتوكول النهج الحالي فقط لتطوير سلالات متحولة تعريف مع العديد من التلاعب الجيني المستهدفة. يوفر هذا البروتوكول طريقة قيمة وفعالة للتلاعب الجيني المستهدفة في Δ ku80 سلالات من المقوسة الغوندية وينطبق على تحليل جين واحد، عائلة من الجينات، أو على نطاق الجينوم دراسات الجينية وظيفية. قبل توافر Δ ku80 سلالات 1،2، وكانت هذه الطرق غير مجدية على نطاق واسع بسبب المعهد الوطني للإحصاءfficiency من هذه الأساليب. وبالتالي، فإن هذا البروتوكول ينطبق على نطاق واسع للتلاعب الجيني المستهدفة من المقوسة الغوندية ومتاح لجميع المحققين مهتمون في معالجة مجموعة من الأسئلة على الطفيليات علم الأحياء، استجابة المضيف، وعلم الجينوم وظيفية.

التوكسوبلازما جوندياي هو مشترك تلزم طفيلي داخل الخلايا التي في كثير من الأحيان ويصيب بشكل مزمن مجموعة واسعة من الحيوانات والبشر 5. وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 1 مليار البشر حاليا وبالعدوى بشكل مزمن من قبل هذا الممرض. بالإضافة إلى أهمية الأمراض التي تسببها T. عدوى المقوسة، وزيادة توفر أدوات تجريبية، والموارد الجينوميات قوي 6، وسهولة في النمو المختبر ونماذج الماوس ممتازة جعلت T. المقوسة نظام نموذجا رائدا لدراسة أوسع نطاقا من مسببات الأمراض بين الخلايا حقيقية النواة وغيرها من الطفيليات apicomplexan كبيرة التي تسبب الأمراض المدمرة مثل الملاريا (المتصورة س.) وآريبتوسبوريديوم (الكريبتوسبوريديوم) 5،7. لقد كان وجود قيود كبيرة من المقوسة الغوندية باعتباره النموذج الحي الانتعاش غير الكفء للذرية التي تحمل تستهدف التلاعب الجيني. هذه مشاكلم في استهداف الجين ويرجع ذلك إلى التردد المنخفض من إعادة التركيب مثلي نسبة إلى تردد عال جدا من إعادة التركيب امتماثلان في السلالات البرية من نوع T. المقوسة حتى عندما يتم توفير التماثل DNA واسعة في الجزيئات المستهدفة الحمض النووي المستخدمة في الدراسات الوراثية 2. ونحن في الآونة الأخيرة منعت وراثيا المسار الرئيسي لإعادة التركيب امتماثلان في النوع الأول والنوع الثاني من سلالات المقوسة التوكسوبلازما عن طريق حذف الجينات التي تشفر بروتين 1،2 KU80. النوع الناتج الأول والنوع الثاني Δ ku80 سلالات تظهر معدلات النمو الطبيعي، وحجم والسلوك على حد سواء في المختبر والمجراة خلال tachyzoite ومراحل المتباطئة في المختبر والمجراة، ومع ذلك، هذه السلالات يحمل أساسا على تردد 100٪ من إعادة التركيب مثلي وهذا النمط الظاهري يزيد من احتمال عزل بسرعة ذرية المطلوب من التلاعب الجيني المستهدفة من قبل عدة مئات إلى عدة ثوusand أضعاف 1،2،4. استخدام الأخيرة على نطاق المجتمع المحلي من النوع الأول والنوع الثاني Δ سلالات ku80 ورفعت بشكل ملحوظ على وتيرة ومتنوعة، فضلا عن نسبة نجاح النهج الوراثية المستهدفة في T. المقوسة 1-4،8-13. نحن هنا وصف بروتوكول شامل للحذف استهداف الجينات، واستبدال الجينات، ووضع علامات الجينات في Δ ku80 سلالات من T. المقوسة. ونحن لشرح كيفية تصميم واستهداف موثوق التلاعب الجيني لجينات معينة أو مواضع الوراثية في Δ ku80 سلالات المقوسة التوكسوبلازما.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

التلاعب الجيني المستهدفة باستخدام إعادة التركيب مثلي هو الأسلوب المفضل لتحليل الجينوم وظيفية للحصول على عرض تفصيلي لوظيفة الجين والنمط الظاهري (ق). تطوير سلالات متحولة مع الحذف المستهدفة الجين، والطفرات المستهدفة، وتكمل وظيفة الجين، و / أو الجينات الموسومة يوفر استراتيجيات قوية لمعالجة وظيفة الجين، لا سيما إذا كانت هذه التلاعب الجيني يمكن أن تستهدف بكفاءة إلى موضع الجينات ذات الاهتمام باستخدام بوساطة التكامل بالنقر المزدوج عبر أكثر من مثلي إعادة التركيب. وقد يرجع ذلك إلى معدلات عالية جدا من امتماثلان إعادة التركيب، والتحليل الجيني وظيفية من المقوسة الغوندية تقتصر في السابق بسبب عدم وجود وسائل فعالة لاستهداف الجينات الحذف والاستبدال الجيني لمواضع جينية محددة. مؤخرا، ونحن ألغى مسارا رئيسيا من إعادة التركيب امتماثلان في النوع الأول والنوع الثاني من سلالات T. المقوسة عن طريق حذف encodin الجينز 1،2 بروتين KU80. سلالات Δku80 تتصرف بشكل طبيعي خلال tachyzoite (الحادة) والمتباطئة مراحل (المزمنة) في التجارب المختبرية والحية ويحمل في جوهره تردد 100٪ من إعادة التركيب مثلي. سلالات ku80 Δ جعل دراسات الجينية وظيفية مجدية على جين واحد، وكذلك على مقياس الجينوم 1-4. هنا، ونحن التقرير أساليب لاستخدام النوع الأول والنوع الثاني سلالات Δku80Δhxgprt لتعزيز نهج استهداف الجينات في T. المقوسة. ونحن الخطوط العريضة وسائل فعالة لتوليد الحذف الجينات، واستبدال الجينات، والجينات الموسومة من قبل الإدراج أو الحذف المستهدفة من هيبوزانتين-الزانثين-جوانين ناقلة الفسفوريبوزيل (HXGPRT) علامة اختيار. الجين هو موضح استهداف بروتوكول يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من الطرق في Δku80 سلالات للنهوض تحليل وظيفي للجينوم الطفيل وتطوير سلالات واحدة التي تحملمتعددة تستهدف التلاعب الجيني. إن تطبيق هذه الطريقة الوراثية وفحوصات المظهري لاحقة تكشف عن جوانب أساسية وفريدة من نوعها لبيولوجيا T. المقوسة وما يتصل بها من مسببات الأمراض البشرية الهامة التي تسبب الملاريا (المتصورة س.) وداء خفيات الأبواغ (الكريبتوسبوريديوم).

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation in ÃŽâ€ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii at JoVE.com

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

نحن هنا التقرير طريقة لاستخدام النوع الأول والنوع الثاني<em&gt; Δku80</em&gt; سلالات<em&gt; التوكسوبلازما جوندياي</em&gt; لتوليد بكفاءة الحذف الجينات المستهدفة وبدائل الجينات لتحليل الجينوم وظيفية.

التلاعب الجيني في<em&gt; Δku80</em&gt; سلالات لتحليل الجينوم الوظيفي لل<em&gt; التوكسوبلازما جوندياي</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

الحصول على عالي النقاء المقوسة الغوندية البيضات من قبل التدرج كلوريد السيزيوم متقطع

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

التوكسوبلازما جدار الكيس الغوندية تشكيل المنشط تقوم البلاعم في نخاع العظام والمستمدة من الشروط المتباطئة

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear الفئران مع الخصوصيات المحددة مسبقا ضد مستقبلات الخلايا T المقوسة الغوندية الحصول عليها عن طريق SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

أخذ البصمات من الحمض النووي المتفطرة الجذامية سلالات باستخدام متغير كرر جنبا الى جنب رقم (VNTR) -- تحليل قطعة الطول (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

شاشة الوراثية لعزل التوكسوبلازما جوندياي المسوخ الخروج المضيف الخلية

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

النهج الوراثية إلى الأمام في<em&gt; الكلاميديا ​​المتدثرة</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

التالية في الوقت الحقيقي تأثير العوامل الالتهاب الرئوي الحاد الفوعة في نموذج الفأر الالتهاب الرئوي عن طريق البكتيريا للإضاءة الحيوية

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

الى الامام علم الوراثة شاشات طريق الضامة لتحديد<em&gt; التوكسوبلازما</em&gt; الجينات هامة الحصانة الذاتية للمقاومة إلى الإنترفيرون γ التي تعتمد على خلية

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...