这项工作得到补助从NIH DJB（AI041930，AI073142，AI075931，AI091461）。

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

作者宣称，他们有没有竞争经济利益。

在这里，我们提供了一个协议，用于有效的基因定位在ΔKu80的寄生虫株基因操纵拥有对象的基因缺失，基因置换和/或标签的基因的后代，以使有效地回收。的顺序执行这些方法提供了可靠的包含单个或多个目标的遗传操作1-3的寄生虫突变体的分离方法。有针对性的删除而产生取决于多种因素，ΔKu80的应变与所提出的策略和协议的使用极大地提高了工作效率和易于精确定义的突变株T.功能基因组研究中的弓形虫 。 基因组的T。弓形虫在无性阶段的单倍体。因此，考虑规划时删除基因，该基因不得在体外至关重要的。然而，效率的圆盾鼎基因敲除在ΔKU80株是非常高，这使隔离显著受损的复制率的突变株。如果有针对性的基因是必不可少的，寄生虫往往在选择过程中停止复制。针对性的基因操纵的另一个关键因素是必须取得至少620 bp的基因组靶向侧翼检测到有针对性的集成，完美的同源性。较长的同源性区域产生更高的效率目标和使用目标约1,000 bp的DNA侧翼是一个可靠和有效的方法1-4。出于这个原因，重要的是产生T的同一菌株的基因组的目标侧翼刚地弓形虫 （RH，保诚）作为操纵基因的菌株。缺乏足够的同源性，经常导致在1个基因组的定位后刀面的靶向整合，但没有其他。不完全整合或未能取得淘汰赛MAŸ也可以由于游离持久。转染后，立即所有的靶向分子的非集成的附加体，有时靶向分子，可以持续许多世代的附加体。 〜1 KBP使用目标DNA侧翼，并继续通过寄生虫在选择之前，再亚克隆经常解决与游离的持久性有关的问题。 一旦淘汰赛进行验证，并除去的HXGPRT标记，基因打靶策略可以重复1-3在一个单一的寄生虫株产生多个基因缺失的第二GOI。缺失，替换，或标记基因的产生，也可以通过使用不同的可选择的标记物（ 博莱霉素，CAT，乙胺嘧啶抗性DHFR等）。 CAT可选择标记虽然目前存在于不同IIΔKu80的保诚基因组1，此标记可以使用HXGPRT除去</&gt;选择这里描述的协议。在我们的手中，HXGPRT选择是最安全和最有效的靶向效率最高的单拷贝针对性插入标记是足够强大的选择在MPA + X介质。HXGPRT还提供了目前唯一有用的方法，有针对性地删除一个可选择的标记（ 图3）使用6 -硫代黄嘌呤（6TX）选择2,3。因此，该协议提供了目前唯一的方法定义的突变株与一些有针对性的遗传操作。 ΔKu80的弓形虫株进行有针对性的遗传操作，该协议提供了一个有价值的和有效的方法，和适用于一个单一的基因，基因家族，或功能基因组的全基因组研究的分析。 ΔKu80的菌株1,2之前，可用的，这些方法尚未得到广泛应用，由于到该INE这些方法fficiency。因此，该协议是广泛适用于有针对性的遗传操作弓形虫和所有感兴趣在寄生虫宿主反应，生物学，功能基因组学的问题上解决一系列调查访问。

弓形虫病是一种常见的专性细胞内原生动物寄生虫，经常和慢性感染动物和人类的广泛的5。据估计，目前超过1亿人是慢性感染这种病菌。除了​​T所引起的疾病的重要性弓形虫感染的实验工具，强大的基因组学资源，提高可用性，易用性在体外生长和优良的小鼠模型T.弓形虫广泛的研究真核细胞病原体和其他重大apicomplexan寄生虫引起严重的疾病，如疟疾（ 恶性 ）。和隐孢子虫（ 隐孢子虫 ）5,7领先的模型系统。 à重大限制弓形虫作为模式生物的后代进行有针对性的遗传操作一直是低效恢复。这的proble基因打靶米是由于同源重组频率低，相对于非同源重组的频率非常高，在野生型菌株T.广泛的DNA同源性弓形虫即使目标DNA分子遗传学研究2。 最近，我们的基因类型的非同源重组的主要途径受阻I型和II株弓形虫通过删除编码的KU80蛋白质1,2基因。由此产生的类型I和II型ΔKu80的菌株表现出正常的生长速率， 在体外和在体内过程中速殖子和bradyzoite阶段的体外和体内的大小和行为，但是，这些菌株表现出基本上是100％的同源重组频率，这表型的可能性增加迅速隔离所需的后代有针对性的遗传操作由几百到几寿美国和倍1,2,4。最近社会广泛使用的类型，I型和IIΔKu80的菌株有显着提升的步伐，品种，以及T中有针对性的遗传方法的成功率弓形虫1-4,8-13。在这里，我们描述了一个全面的协议，有针对性的基因缺失，基因置换，基因标记ΔKU80株T.弓形虫 。我们演示了如何设计和可靠的目标遗传操作特定的基因或基因位点在ΔKU80株弓形虫。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

针对性的遗传操作使用同源重组的方法的选择功能基因组学分析，以获得基因的功能和表型（次）的详细视图。与靶基因缺失，有针对性的突变，传统的基因的功能，和/或标签的基因的突变株的发展提供了强有力的战略，以处理基因的功能，尤其是当这些基因操作可以有效地针对感兴趣的使用整合介导的基因位点，通过双击跨越同源重组。 由于非同源重组，功能基因组学分析弓形虫率非常高的情况下有效的方法，针对特定基因位点的基因缺失和基因替换先前已限制。最近，我们取消了非同源重组的主要途径，在I型和II型菌株T.弓形虫删除基因encodin克的KU80蛋白质1,2。 Δku80株正常工作过程中速殖子（急性）和bradyzoite（慢性） 在体外和体内的阶段，并表现出基本上是一个100％的同源重组频率。 ΔKu80的菌株进行功能基因组学研究可行的单一基因，以及基因组规模1-4。 在这里，我们报告的方法使用类型I型和IIΔku80Δhxgprt株推进T中的基因打靶方法弓形虫 。我们概述了用于产生对象的次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）可选择标记的插入或缺失的基因缺失，基因置换和标记基因的有效方法。所描述的基因打靶协议可以用在多种方式推进Δku80株寄生虫基因组功能分析和开发单一菌株进行多个有针对性的遗传操作。这种遗传方法的应用和随后的表型分析将揭示T.生物学方面的基础和独特的弓形虫和相关重大人类病原体引起的疟疾（ 恶性 ）。和隐孢子虫病（ 隐孢子虫 ）。

提供的模板的详细构造一个目标质粒删除的基因，包括限制性酶切位点的位置和生成，促进基因定位和基因打靶技术的验证，以及为随后删除HXGPRT，在质粒构建的引物单步的过程（ 图1A-C，图2A，图3A）。作出有针对性的基因缺失（ 图2A），用来验证的淘汰赛删除的引物对，例如，I型rop18（ 图2B），以及具有代表性的PCR验证结果的一般原理图 （ 图2C）。此代表性的结果示出为说明结果的范围内，可以得到在基因位点是比较困难的目标。成功的目标的基因的缺失将导致在没有的基因，在感兴趣的PCR产物（PCR 1），3&#39;的基因组的目标侧翼（PCR2）的存在下，以及存在的HXGPRT适当整合的可选择的标记之间的5&#39;和3&#39;的基因组的目标侧翼定义的删除（PCR3及PCR4） 。验证克隆3，4，5，6，8，9，和11有针对性的基因缺失（击倒）HXGPRT已经取代了印度政府（ 图2C）。 表示不包含基因缺失的克隆，可以由各种不同的条带模式。通常情况下，没有基因缺失的克隆将镜像亲本株（亲柄）与PCR1和PCR2的观察到的波段，但不为PCR3或PCR4看到的克隆1和2（ 图2C）。这种“家长模式”源于一些潜在的机制。有时候，MPA抗寄生虫进行非集成坚持附加体pΔGOI目标质粒，我们注意到，继续选择常常迫使这些附加体集成。我们也观察到一些罕见的背景不同IΔKu80的菌株由于集成的pΔGOI意外定位质粒其中包含一个的HXGPRT cDNA的通过表达DHFR的 5&#39;和3&#39;的启动子元件，到DHFR基因座或到部分删除的HXGPRT的轨迹14。虽然这种罕见的事件是有针对性的整合，它不是旨在整合和作为一个关键点要记住在设计任何基因替换策略。质粒DNA同源性进行您的pΔGOI针对大于120个基点可能会提供一个替代网站重组在ΔKU80株2，可以给一个不受欢迎的背景中。在这样的背景下，减少或不存在的相比，I型II型保诚ΔKu80的菌株因为是基于I型序列核苷酸多态性时相比，II型DNA的HXGPRT可选择标记大大降低了这一难得的背景在实验中使用II型PRUΔKU80应变1。如果一个基因位点是必不可少的（不能删除），或有一个极低的基因靶向频率轨迹，或如果坚持[]附加体都是不容易消除了通过增长和选择非集成，这种父母的格局将主宰观察MPA的图案抗性克隆。另外，有时可观察到靶向DNA分子只在5&#39;或3&#39;的基因组的目标侧翼和一个带观察为PCR3或PCR4（但不是两者）看到随着PCR1和PCR2在克隆10（5集成集成）和克隆7（3&#39;整合）（ 图2C）。这些模式表明单个交叉的不经常发生的，在上面的轨迹，集成的HXGPRT，但此对象的集成不删除感兴趣的基因为目标的质粒整合。这种模式（泳道7＆10 图2C）EM强调说需要报告PCR数据验证，定点整合的发生，而不是一个单一的同源跨越的目标分子的第二非同源整合。在极少数情况下，我们观察到基因的克隆12（ 图2C），表示父母图案和有针对性的删除模式表示的混合物。这种模式最有可能产生有时从两个克隆以及在同一地点存在的寄生虫基因型。 示出的一般原理用于去除的HXGPRT来自Δku80Δgoi的:: HXGPRT删除HXGPRT的应变（ 图3A）。的引物对用于验证从ΔKu80的ΔGRA2 :: HXGPRT（ 图3B）的去除HXGPRT PCR5的一个独特〜1.2 kbp的带放大看到克隆4，第7，第9，第11和12（ 图3C）。如果不从HXGPRT的轨迹，3〜。4 KBP波段（克隆1，2，3，6，8，10，和父母控制）。几种机制的作用，使去除HXGPRT（6TX选择）更具挑战性和一体化的HXGPRT（MPA + X选择）的效率比。 MPA的选择是简单更有效率大于6TX选择14,16。此外，更高的水平的HXGPRT表达需要为的挑选6TX比MPA选择16,24。因此，可能减少HXGPRT的酶活性或基因突变或表观遗传学变化，减少在一个基因的基因表达水平的HXGPRT的突变，有可能取消的有效性选择6TX。即使有了这些挑战6TX选择的的挑选6TX在ΔKu80的菌株，成功率大于90％1-3在第一次尝试。 直接的C-末端标记的蛋白编码基因的一般方案（ 图4）所示。这计划采用直接集成通过3 HXGPRT&#39;的标记基因同源重组的双重跨越，也采用类似上述的验证策略。当一个基因被怀疑是一个不可缺少的基因，这可以使用第二个独立隔离的目标DNA质粒转染验证。替代的方法，如计划调控基因的表达，可用于进一步核实是必不可少的，如果一个基因25。 <img alt="图1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> 图1。靶向DNA质粒的设计概述。 。设计示意图重叠引物PCR扩增5&#39;和3&#39;目标侧翼的pRS416穿梭载体和HXGPRT的小基因盒的33 bp的重叠。在原理图中所示的引物为用于产生的5&#39;和3&#39;靶的侧翼pΔROP1810 B.设计目标DNA分子的整体策略。骨干pΔGOIpRS416穿梭载体含尿嘧啶（市建局）和氨苄青霉素（AMP）可选择的标记。 pRS416插入的是一个1〜的KBP 5的DNA扩增基因组DNA的HXGPRT小基因盒和pRS416使用F1和R1引物重叠的目标侧翼，1〜3 KBP&#39;从基因组DNA扩增目标DNA侧翼重叠HXGPRT小基因盒pRS416使用F2和R2引物和HXGPRT的小基因盒。以下独特的限制性内切酶消化站点被添加到引物：RE.X中的F1引物（限制性内切酶的X剪切站点）切割质粒在目标DNA的5&#39;侧翼的5&#39;末端，在R2 RE.Y切割的质粒的引物中的R1和F2的引物在3&#39;端的3&#39;的目标DNA侧翼和RE.Z切除HXGPRT分钟盒式igene C.引物序列，用于生成靶向构建体删除rop18。 黑体区域对应到T。刚地弓形虫基因组序列，以及的nonbold区域对应的限制酶位点重叠与pRS416在HXGPRT小基因盒的序列。 HX_F和HX_R底漆对放大HXGPRT的小基因盒14。读取的引物从5&#39;至3&#39;。表改编从芬特雷斯等[10]。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">点击这里查看大图</a> 。 <img alt="图2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> 图2。概述删除使用HXGPRT基因的协议。 Disruptio。n的双交叉同源重组事件使用〜的KBP 5 DNA目标侧翼〜1 KBP 3&#39;目标DNA侧翼质粒pΔGOI的的GOI的Δku80Δhxgprt株。 PCR1的PCR策略，PCR2，PCR3，PCR4（不按比例），使基因型验证，验证克隆有针对性地整合HXGPRT印尼政府轨迹和删除。B.代表底漆对设计验证删除rop18 。ROP18_DF ROP18_DR放大PCR1，ROP18_ExF ROP18_CxR的扩增PCR2，ROP18_CxF DHFR_CxR的放大PCR3 DHFR_CxF的和ROP18_CxR放大PCR4（ 见图2A）。读取的引物从5&#39;至3&#39;。表改编从芬特雷斯等：10 C.代表结果验证靶基因的缺失（rop18）使用HXGPRT的。以下转染质粒pΔROP18的成Δku80Δhxgprt和选择在MPA +X，MPA +所述抗性克隆父母应变控制删减rop18。PCR 1（400个基点）和PCR（〜650 bp）的产品是积极的和消极（〜1200 bp的PCR 3）和PCR检测4（约1,300 bp）的产品。 GOI淘汰赛是有针对性积极为PCR2，PCR3 PCR4的产品和为负的PCR 1产品（ 见图2A）。 PCR1和PCR2（ 上图 ）的结果，代表面板PCR3（ 中图 ），和PCR4（ 底部面板）所示。克隆3，4，5，6，8，9和11表现出正确的带型的PCR 1，PCR2，PCR3和PCR4定义有针对性的基因缺失事件在克隆。克隆1，2，7，10和12是没有基因缺失，对应于其他潜在的有代表性的结果。 （C =家长控制应变Δku80Δhxgprt，M =大小标记） <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a> 。 <img alt="图3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> 图3。的协议重新定位感兴趣的基因删除HXGPRT的概述。 A.战略的HXGPRT去除选择标记的双交换同源重组事件在应变Δku80Δgoi的:: HXGPRT使用〜的KBP 5 DNA目标侧翼和一个1〜的KBP 3的DNA目标侧翼质粒pΔGOIc的的。 PCR基因型验证策略描绘的检测用引物对的PCR产物（PCR5）跨越删除（不按比例）。B.甲代表性的设计的引物对从GRA2验证去除可选择标记HXGPRT轨迹应变Δku80Δgra2中:: HXGPRT引物GRA2 _CLF GRA2_CxR扩增PCR5。引物<html>读取从5&#39;至3&#39;。C.代表面板，可以得到下面的转染与Δku80Δgoi:: HXGPRT和选择6TX质粒pΔGOIc到的耐6TX克隆。无性系4，第7，第9，第11和12表现出正确的带型的PCR5对应的对象删除的HXGPRT标记（〜1.2 kbp的产品，跨越的3&#39;与5&#39;侧翼和以外的3&#39;侧翼有轻微的重叠侧翼）。克隆1，2，3，6，8和10（该频带光）代表预期的条带图案的周围〜3.4 kbp的亲本克隆基因型对应，即使这些克隆表现出一定程度的阻力，容许6TX他们的选择（此型可偶尔油然而生关机的HXGPRT表达（ 见附注协议2.1（第8步）和代表性的成果部分）（C =家长控制应变Δku80Δgoi:: HXGPRT的 ，M =大小标记）。w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg“目标=”_blank“&gt;点击这里查看大图。 <img alt="图4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> 图4。设计的一个目标标记的蛋白质的C-末端的DNA分子。策略是基于的能力的HXGPRT标记，也可作为3&#39;下游的调节区。的骨干pΔGOItag的pRS416穿梭载体含有尿嘧啶（市建局）及氨苄青霉素（AMP）选择标记。 〜1 5 KBP&#39;目标DNA扩增基因组DNA的侧翼重叠HXGPRT小基因盒和pRS416使用Fgoi引物RTAG，重叠了〜1 KBP 3&#39;从基因组DNA扩增目标DNA侧翼插入pRS416 HXGPRT小基因盒和pRS416使用F2和R2引物和在HXGPRT小基因盒。的5&#39;DNA靶侧翼带有标签（HA，Myc基因，他等），然后由一个替换的终止密码子，终止密码子替换。 MPA + X选择集成的C-末端的标签和的下游HXGPRT，和移动的3&#39;端非编码区的位置后HXGPRT标记。以下独特的限制性内切酶消化网站已加入引物：RE.X在Fgoi引物（限制性内切酶的X剪切站点）切割质粒在目标DNA的5&#39;侧翼的5&#39;末端，并在RE.Y的R2引物切割质粒的3&#39;末端的3&#39;DNA靶侧翼，在rtag命令和F2引物和RE.Z切除HXGPRT的的小基因盒用于质粒构建重新定位标记的基因位点删除HXGPRT标记将恢复安置的3&#39;UTR。

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Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

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