Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH til DJB (AI041930, AI073142, AI075931 og AI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Her giver vi en protokol til effektiv genmålretning i Δ Ku80 parasitstammer at muliggøre effektiv inddrivelse af genetisk manipulerede afkom, der besidder målrettede gendeletioner, gen udskiftninger, og / eller mærkede gener. Den sekventielle udførelse af disse metoder giver en pålidelig fremgangsmåde til isolering af parasitten mutanter, der indeholder en enkelt eller flere målrettede genetiske manipulationer 1-3. Mens dannelsen af en målrettet deletion afhænger af flere faktorer, brugen af Δ Ku80 stamme med den præsenterede strategi og protokol øger effektiviteten og nem at gøre præcist definerede mutantstammer af T. gondii for funktionelle genomiske studier. Genomet af T. gondii under ukønnede stadier er haploide. Således vil en overvejelse at gøre, når du planlægger at slette et gen er, at genet ikke må være afgørende in vitro. Ikke desto mindre effektivitet Angrebsskjoldetteret gen knockouts i Δ Ku80 stammer er ekstremt høj, og dette muliggør isolering af muterede stammer med væsentligt forringede replikation satser. Hvis en målrettet gen er afgørende, parasitter ofte ophøre med at replikere under selektion. En anden afgørende faktor i målrettet genetisk manipulation er det perfekte homologi med mindst 620 bp af det genomiske målretning flanke er nødvendig for at opnå påviselige målrettede integrationer 2.. Længere homologiregioner producere højere virkningsgrader målrette og bruge målretning DNA flankerne af cirka 1.000 bp er en pålidelig og effektiv tilgang 1-4. Af denne grund er det vigtigt, at genomiske målretning flanker er genereret ud fra den samme stamme af T. gondii (RH, Pru) som stamme, der bliver genetisk manipuleret. Mangel på tilstrækkelig homologi kan ofte resultere i målrettet integration af et genomisk målretning flanke, men ikke den anden. Ufuldstændig integration eller manglende opnå en knockout may også skyldes episomalt vedholdenhed. Umiddelbart efter transfektion alle de målsøgende molekyler ikke-integreret episomer, og undertiden målsøgende molekyler kan forblive som episomer i mange generationer. Hjælp mål-DNA flanker ~ 1 Kbp og fortsat at passere parasitter under selektion før re-subkloning ofte løser problemer forbundet med episomal vedholdenhed. Når en knockout er valideret, og HXGPRT markør er fjernet, kan det gen målretningsstrategi gentages ved en anden indiske regering til at generere flere gendeletioner i et enkelt parasit stamme 1-3. Generering af deletioner, udskiftninger eller mærkede gener kan også opnås ved hjælp af forskellige selekterbare markører (bleomycin, CAT, pyrimethamin resistent DHFR, osv.). Selvom CAT selekterbare markør i øjeblikket er til stede i type II-Δ Ku80 Pru genom 1, kan denne markør fjernes med HXGPRT </em&gt; valg-protokol beskrevet her. I vores hænder, er HXGPRT valg den sikreste og mest effektive markør med den højeste målrettet effektivitet, hvor en enkelt kopi målrettet indsættelse er tilstrækkelig til robust udvælgelse i MPA + X medium. HXGPRT giver også den eneste i øjeblikket nyttig metode til målrettet sletning af en selekterbar markør (fig. 3) under anvendelse af 6-thioxanthin (6TX) udvælgelse 2,3. Således denne protokol giver den eneste nuværende tilgang til udvikling af definerede mutantstammer med flere målrettede genetiske manipulationer. Denne protokol giver en værdifuld og effektiv metode til målrettet genmanipulation i Δ Ku80 stammer af Toxoplasma gondii, og er gældende for analyse af et enkelt gen, en familie af gener, eller genom-dækkende funktionelle genomiske studier. Forud for tilgængeligheden af Δ Ku80 stammer 1,2, disse tilgange var ikke bredt gennemførlige på grund af inefficiency af disse metoder. Derfor denne protokol er bredt anvendelig til målrettet genmanipulation af Toxoplasma gondii og er tilgængelig for alle investigatorer interesseret i at løse en række spørgsmål om parasit biologi, værtsrespons og funktionel genomik.

Toxoplasma gondii er en fælles obligat intracellulær protozoparasit der hyppigt og kronisk inficerer en bred vifte af dyr og mennesker 5. Det anslås, at mere end 1 milliard mennesker er i øjeblikket og kronisk inficeret af dette patogen. Ud over betydningen af sygdom forårsaget af T. gondii infektion, den øgede tilgængelighed af eksperimentelle værktøjer, kraftfulde genomics ressourcer 6, nem in vitro vækst og gode musemodeller har gjort T. gondii en førende model for den bredere undersøgelse af intracellulære eukaryote patogener og andre væsentlige apicomplexan parasitter, der forårsager ødelæggende sygdomme såsom malaria (Plasmodium sp.) og Cryptosporidiose (Cryptosporidium) 5,7. En væsentlig begrænsning af Toxoplasma gondii som en model organisme har været ineffektiv inddrivelse af afkom, der bærer målrettet genetiske manipulationer. Denne problem gentargeting skyldes en lav frekvens af homolog rekombination i forhold til den meget høje frekvens af homolog rekombination i vildtype-stammer af T. gondii selv når omfattende DNA homologi tilvejebringes i DNA-målmolekyler, der anvendes i genetiske undersøgelser 2. Vi har for nylig genetisk blokeret vigtig vej homolog rekombination i type I og type II-stammer af Toxoplasma ved at slette det gen der koder for Ku80 proteinet 1,2. Den resulterende type I og type II Δ Ku80 stammer udviser normale vækstrater, størrelse og adfærd både in vitro og in vivo under tachyzoite og bradyzoite stadier in vitro og in vivo, men disse stammer udviser væsentlige en 100% frekvens af homolog rekombination og dette fænotype øger sandsynligheden for hurtigt at isolere den ønskede afkom af målrettede genetiske manipulationer af flere hundrede til flere thousand-fold 1,2,4. Nyere EU-dækkende brug af type I og type II Δ Ku80 stammer har markant optrappet tempoet, sorten, samt succesraten for målrettede genetiske tilgange i T. gondii 1-4,8-13. Her beskriver vi en omfattende protokol for målrettet gendeletion genudskiftning og gen-tagging i Δ Ku80 stammer af T. gondii. Vi viser, hvordan man designer og pålideligt målrette genetiske manipulationer til bestemte gener eller genetiske loci i Δ Ku80 stammer af Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Målrettet genmanipulation hjælp homolog rekombination er den foretrukne metode til funktionel genomisk analyse for at få et detaljeret billede af gen-funktion og fænotype (r). Udviklingen af ​​mutantstammer med målrettede gendeletioner, målrettede mutationer, suppleret genfunktion og / eller mærkede gener giver effektive strategier til at løse genfunktion, især hvis disse genetiske manipulationer effektivt kan målrettes til genet locus af interesse ved hjælp af integration medieret af dobbelt krydse over homolog rekombination. Grundet meget høje homolog rekombination, funktionelle genomisk analyse af Toxoplasma gondii er tidligere blevet begrænset af manglen på effektive metoder til målretning gendeletioner og gen-erstatninger til specifikke genetiske loci. For nylig, vi afskaffede vigtig vej homolog rekombination i type I og type II-stammer af T. gondii ved at slette genet encoding den Ku80 protein 1,2. De Δku80 stammer opføre sig normalt under tachyzoite (akut) og bradyzoite (kronisk) Forløb in vitro og in vivo og udviser væsentlige en 100% frekvens af homolog rekombination. De Δ Ku80 stammer lave funktionelle genomiske undersøgelser muligt på enkelt gen samt på genomet skalaen 1-4. Her rapporterer vi metoder til anvendelse type I og type II Δku80Δhxgprt stammer til fremme gen-targeting tilgange i T. gondii. Vi skitserer effektive metoder til at generere gendeletioner, gen udskiftninger, og mærkede gener ved målrettet indsættelse eller sletning af hypoxantin-xanthin-guaninphosphoribosyltransferase (HXGPRT) markør. Den beskrevne gene targeting protokol kan bruges i en række forskellige måder i Δku80 stammer til fremme funktionel analyse af parasitten genomet og udvikle enkelte stammer, der bærerflere målrettede genetiske manipulationer. Anvendelsen af denne genetiske fremgangsmåde og efterfølgende fænotypiske assays vil afsløre fundamentale og unikke aspekter af biologi T. gondii og tilhørende betydelige menneskelige patogener, der forårsager malaria (Plasmodium sp.) og cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

En detaljeret skabelon leveres til konstruktion en målsøgende plasmid at slette et gen, herunder placeringen af restriktionsenzymsteder og generering af de primere, der letter genetiske targeting og validering af gen-targeting, samt plasmidkonstruktion for efterfølgende sletning af HXGPRT i en enkelt proces (Figur 1A-C, figur 2A, 3A). En generel skematisk præsenteres for at gøre en målrettet gendeletion (figur 2A), primerparrene anvendes til validering sletning af en knockout, for eksempel, er type I rop18 (figur 2B), og repræsentative resultater af PCR valideringen vist (fig. 2C). Denne repræsentativt resultat er vist for at illustrere forskellige resultater, der kan opnås ved genetiske loci, der er relativt vanskelige at målrette. En succes målrettet genet vil resultere i fravær af genet af iinteresse PCR-produkt (PCR 1), tilstedeværelsen af 3&#39;genomiske målretning flanke (PCR2), og tilstedeværelsen af den HXGPRT selekterbare markør integreres ordentligt mellem 5&#39;-og 3&#39;-genomiske målretning flanker, der definerer sletningen (PCR3 og PCR4) . Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 og 11 er validerede målrettet gendeletioner (knockouts) hvor HXGPRT har erstattet den indiske regering (Figur 2C). En klon, som ikke indeholder en gendeletion kan være repræsenteret ved en række båndmønstre. Typisk vil en klon uden en gendeletion afspejle forældrenes stamme (forældrenes mønster) med bands observeret for PCR1 og PCR2, men ikke for PCR3 eller PCR4 set for kloner 1 og 2 (figur 2C). Denne &quot;forældrenes mønster&quot; opstår fra et par potentielle mekanismer. Lejlighedsvis, MPA resistente udvalgte parasitter bære ikke-integreret vedvarer episomer af pΔGOI målretning plasmid, og vi konstatere, at fortsat selektion ofte tvinger disse episomertil at integrere. Vi også observere nogle sjældne baggrund i type I Δ Ku80 pres, fordi utilsigtet integration af pΔGOI målretning plasmid, som indeholder et HXGPRT cDNA udtrykt via DHFR 5&#39;-og 3&#39;-promotorelementer, i enten DHFR locus eller i det delvist slettet HXGPRT locus 14.. Mens denne sjældne begivenhed er en målrettet integration, var det ikke den tilsigtede integration og tjener som et centralt punkt at huske i udformningen af ​​ethvert genudskiftning strategi. DNA homologi større end 120 bp transporteres på din pΔGOI målretning plasmid kan være et alternativ site for rekombination i Δ Ku80 stammer 2, der kan give tilbage en uønsket baggrund. I type II Pru Δ Ku80 stamme denne baggrund er reduceret eller ikke-eksisterende i forhold til type I, fordi HXGPRT selekterbare markør er baseret på type I-sekvenser, der har nucleotide polymorphisms sammenlignet med type II-DNA, somreducerer denne sjældne baggrund ved forsøg med type II Pru Δ Ku80 stammen 1.. Hvis et gen locus er afgørende (kan ikke slettes) eller har et meget lavt genmålretning frekvensen ved locus, eller hvis vedvarende [ikke-integreret] episomer ikke let elimineres via vækst og udvælgelse, vil dette forældrenes mønster dominerer mønsteret observeret i MPA resistente kloner. Alternativt er det målsøgende DNA-molekyle undertiden observeret at integrere på kun 5 &#39;eller 3&#39; genomiske målretning flanke og et bånd observeres for enten PCR3 eller PCR4 (men ikke begge) sammen med PCR1 og PCR2 som ses for klon 10 (5 &#39;integration) og klon 7 (3&#39; integration) (Figur 2C). Disse mønstre antyder den sjældne forekomst af en enkelt cross over integration af targeting plasmid ved locus, der integrerer HXGPRT men dette målrettet integration ikke slette genet af interesse. Dette mønster (bane 7 &amp; 10 i figur 2C) emphasizes behovet for at rapportere PCR oplysninger til at efterprøve, at en målrettet integration opstod i stedet for en enkelt homolog krydse over og en anden homolog integration af målsøgende molekyle. Sjældent vi observerer en genetisk blanding repræsenteret ved klon 12 (figur 2C), som repræsenterer både en forældre mønster og en målrettet sletning mønster. Dette mønster sandsynligvis opstår lejlighedsvis fra to parasit genotyper der er til stede på samme sted i en kloning godt. En generel skematisk til fjernelse af HXGPRT fra Δ ku80Δgoi :: HXGPRT at slette HXGPRT fra stammen vist (figur 3A). Primerparret bruges til at validere fjernelsen af HXGPRT fra Δ Ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (figur 3B) forstærker en unik ~ 1,2 kbp bånd i PCR5 som set i klonerne 4, 7, 9, 11 og 12 (figur 3C). Hvis HXGPRT ikke fjernes fra locuset, en ~ 3.4 Kbp bånd observeret (kloner 1, 2, 3, 6, 8, 10, og forældrekontrol). Adskillige mekanismer handle for at gøre fjernelsen af HXGPRT (6TX udvælgelse) mere udfordrende og mindre effektive end integrationen af HXGPRT (MPA + X udvælgelse). MPA valg er simpelthen mere effektiv end 6TX valg 14,16. Desuden er højere niveauer af HXGPRT udtryk nødvendig for 6TX udvælgelse end for MPA valg 16,24. Derfor kan mutationer, der kan reducere HXGPRT enzymaktivitet eller mutationer eller epigenetiske ændringer, der reducerer ekspressionsniveauet af HXGPRT på et gens locus potentielt afskaffe effektivitet 6TX udvælgelse. Selv med disse udfordringer 6TX udvælgelse, er succesraten for 6TX udvælgelse i Δ Ku80 stammer mere end 90% i første forsøg 1-3. En generel ordning for direkte C-terminal mærkning af protein-kodende gener er vist (figur 4). DetOrdningen bruger direkte integration via dobbelt cross over homolog rekombination af HXGPRT 3 &#39;for mærkede genet og også beskæftiger validering strategier svarende til de ovenfor beskrevne. Når et gen er mistænkt for at være et vigtigt gen dette kan kontrolleres ved hjælp af en anden transfektion med et selvstændigt isoleret målrettet DNA plasmid. Alternative metoder, såsom ordninger for reguleret genekspression, er til rådighed for yderligere at kontrollere, om et gen er afgørende 25.. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figur 1. Oversigt over konstruktionen af en targeting DNA-plasmid. A. Skematisk for at designe overlapper primere anvendt til PCR forstærke 5&#39;-og 3&#39;target flanker med 33 bp overlap for pRS416 shuttle vektor og HXGPRT minigen kassetten. Primere afbildet i skematisk varanvendes til at generere de 5&#39;-og 3&#39;-target flanker pΔROP18 10.. B. Generel strategi for at designe et målsøgende DNA-molekyle. Rygraden i pΔGOI er pRS416 shuttle vektor, der indeholder uracil (URA) og ampicillin (AMP) valgbare markører. Indsat i pRS416 er en ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-mål flanke amplificeret fra genomisk DNA med overlapninger for HXGPRT minigenet kassetten og pRS416 hjælp F1 og R1 primere, en ~ 1 Kbp 3&#39; er DNA-mål flanke amplificeret fra genomisk DNA med overlapninger den HXGPRT minigenet kassetten og pRS416 hjælp af F2 og R2 primere og HXGPRT minigen kassette. Følgende unikke restriktionsenzymsteder fordøje sites føjes til primerne: RE.X (restriktionsenzym X kløvningspunkt) i F1 primer til skære plasmidet ved 5&#39;-enden af ​​5&#39;-DNA-mål flanke, RE.Y i R2 primer at skære plasmidet ved 3&#39;-enden af 3 &#39;DNA-mål flanke og RE.Z i R1 og F2 primere til udskære HXGPRT minigene kassette. C. Primersekvenser anvendt til at generere målkonstruktionen for sletning af rop18. Den dristige regioner svarer til T. gondii-genomiske sekvens, og de ​​nonbold regionerne svarer til de restriktionsenzymsteder og sekvenser, der overlapper med pRS416 og HXGPRT minigen kassetten. Den HX_F og HX_R primerpar amplificerer HXGPRT minigen kassetten 14.. Primere læses fra 5 &#39;til 3&#39;. Tabel tilpasset fra Fentress m.fl. 10.. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figur 2. Overblik af protokollen for sletning af et gen ved hjælp HXGPRT. A. Disruption af GOI i Δ ku80Δhxgprt stammen af en dobbelt crossover homolog rekombination begivenhed ved hjælp af en ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-mål flanke og en ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-mål flanke på plasmid pΔGOI. En PCR-strategi ved hjælp PCR1, PCR2, PCR3 og PCR4 (ikke målfast) vises der gør det muligt genotype verifikation at validere kloner med en målrettet integration af HXGPRT og sletning af den indiske regering locus. B. Repræsentative primerpar designet til at validere sletning af rop18 . ROP18_DF og ROP18_DR forstærke PCR1, ROP18_ExF og ROP18_CxR forstærke PCR2, ROP18_CxF og DHFR_CxR forstærke PCR3 og DHFR_CxF og ROP18_CxR forstærke PCR4 (se figur 2A). Primere læses fra 5 &#39;til 3&#39;. Tabel tilpasset fra Fentress m.fl. 10. C. Repræsentative resultater af validering af en målrettet gendeletion (rop18) ved hjælp HXGPRT. Efter transfektion af plasmid pΔROP18 ind Δ ku80Δhxgprt og udvælgelse i MPA +X, MPA + X resistente kloner blev analyseret for sletning af rop18. Den parentale stamme kontrol er positiv for PCR 1 (~ 400 bp) og PCR 2 (~ 650 bp) produkt-og negativ for PCR 3 (~ 1.200 bp) og PCR 4 (~ 1.300 bp) produkt. En målrettet GOI knockout er positivt for de PCR2, pCR3 og PCR4 produkter, og er negativ for PCR 1 produkt (se figur 2A). Vist er repræsentative paneler af resultaterne af PCR1 og PCR2 (øverste panel), pCR3 (midterste panel), og PCR4 (nederste panel). Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 og 11 udviser den korrekte båndmønster PCR 1, PCR2, PCR3 og PCR4 der definerer en målrettet genet begivenhed i klonen. Kloner 1, 2, 7, 10 og 12 er ikke gendeletioner, og svarer til andre potentielle repræsentative resultater. (C = forældrekontrol stamme Δ ku80Δhxgprt, M = størrelse markører). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se større figur</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figur 3. Oversigt over protokollen for re-targeting genet af interesse at slette HXGPRT. A. Strategi for fjernelse af HXGPRT markør af en dobbelt crossover homolog rekombination begivenhed i stammen Δ ku80Δgoi :: HXGPRT hjælp af en ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-mål flanke og en ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-mål flanke på plasmid pΔGOIc. PCR strategi for genotype verifikation er afbildet ved hjælp af et primerpar til analyse for et PCR-produkt (PCR5), der spænder over deletion (ikke målfast). B. En repræsentativ primerpar udformet til at validere fjernelse af HXGPRT selekterbare markør fra gra2 locus i stammen Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primere GRA2 _CLF og GRA2_CxR forstærke PCR5. Primere<html> læses fra 5 &#39;til 3&#39;. C. repræsentativt panel af 6TX-resistente kloner, som kan opnås efter transfektion af plasmid pΔGOIc ind Δ ku80Δgoi :: HXGPRT og udvælgelse i 6TX. Kloner 4, 7, 9, 11 og 12 udviser den korrekte båndmønster af PCR5 der svarer til målrettet deletion af HXGPRT markør (~ 1,2 Kbp produkt der spænder over 3&#39;-flanke med svag overlapning med 5&#39;flanke og uden 3&#39; flanke). Kloner 1, 2, 3, 6, 8 og 10 (dette bånd er lys) repræsenterer den forventede båndmønster på omkring ~ 3,4 kbp, der svarer til den parentale klon genotype, selvom disse kloner udviste en grad af resistens over for 6TX som tilladt deres valg (denne fænotype kan lejlighedsvis opstå spontant nedlukning af HXGPRT udtryk (se note i protokol 2.1 (trin 8), og Repræsentant afsnittet Resultater). (C = forældrekontrol stamme Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = størrelse markører).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik her for at se større figur. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figur 4.. Design af et målsøgende DNA-molekyle for at mærke den C-terminale ende af et protein. Strategien er baseret på evnen af HXGPRT markør til også fungere som en 3 &#39;nedstrøms regulatoriske region. Rygraden i pΔGOItag er pRS416 shuttle vektor, der indeholder uracil (URA) og ampicillin (AMP) valgbare markører. Indsat i pRS416 er en ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-mål flanke amplificeret fra genomisk DNA med overlapninger for HXGPRT minigenet kassette og pRS416 bruge Fgoi og Rtag primere, en ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-mål flanke er blevet amplificeret fra genomisk DNA med overlapninger Den HXGPRT minigenet kassette og pRS416 hjælp af F2 og R2primere og HXGPRT minigenet kassetten. 5&#39;DNA-mål flanke erstatter termineringskodon med tagget (HA, Myc, His, osv.) efterfulgt af en udskiftning termineringskodon. MPA + X udvælgelse integrerer den C-terminale-tag og en nedstrøms HXGPRT og flytter 3&#39;UTR til en stilling efter HXGPRT markør. Følgende unikke restriktionsenzymsteder fordøje sites føjes til primerne: RE.X (restriktionsenzym X kløvningspunkt) i Fgoi primeren at skære plasmidet ved 5&#39;-enden af ​​5&#39;-DNA-mål flanke, og RE.Y i R2 primer at skære plasmidet ved 3&#39;-enden af 3 &#39;DNA-mål flanke, og RE.Z i Rtag og F2 primere til udskære HXGPRT minigenet kassette til brug for plasmid konstruktion at re-målrette det kodede gen locus at slette den HXGPRT markør, der vil genoprette placeringen af 3&#39;UTR.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation in ÃŽâ€ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii at JoVE.com

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Her rapporterer vi en fremgangsmåde til anvendelse af type I og type II<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer af<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Til effektivt at generere målrettede gendeletioner og gen-erstatninger til funktionel genomisk analyse.

Genetisk Manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer til Functional Genomisk Analyse af<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En genetisk skærm for at isolere Toxoplasma gondii Host-celle afstigningstrin Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetiske tilgange i<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Efter i Real Time konsekvenserne af Pneumokok virulensfaktorer i en akut Mouse Lungebetændelse Model Brug Bioluminescent Bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging af myeloide celler dynamik i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumorer ved Spinning Disk Konfokal mikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetik skærme med makrofager til at identificere<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Vigtigt for Modstand mod IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immunitet

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...