इस काम में दिल्ली जल बोर्ड के लिए एनआईएच से अनुदान (AI041930, AI073142, AI075931, और AI091461) द्वारा समर्थित किया गया था.

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

यहाँ हम लक्षित जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन, और / या टैग किए गए जीन के अधिकारी है कि आनुवंशिक रूप से चालाकी से संतान के कुशल वसूली को सक्षम करने Δ KU80 परजीवी उपभेदों में लक्षित कुशल जीन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इन तरीकों में से अनुक्रमिक निष्पादन 1-3 एकल या एकाधिक लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ होते हैं कि परजीवी म्यूटेंट के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. एक लक्षित हटाए जाने की पीढ़ी के कई कारकों पर निर्भर करता है, प्रस्तुत रणनीति और प्रोटोकॉल के साथ Δ KU80 तनाव का उपयोग बहुत टी. की ठीक से परिभाषित उत्परिवर्ती उपभेदों बनाने की दक्षता और आराम बढ़ जाती है कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के लिए gondii. टी. के जीनोम अलैंगिक चरणों के दौरान gondii अगुणित है. इस प्रकार एक जीन को हटाने के लिए योजना बनाते समय बनाने के लिए एक विचार जीन इन विट्रो में आवश्यक नहीं होना चाहिए. बहरहाल, targe की दक्षताΔ KU80 उपभेदों में टिंग जीन knockouts के अत्यंत उच्च है, और यह काफी बिगड़ा हुआ प्रतिकृति दरों के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. एक लक्षित जीन आवश्यक है, परजीवी अक्सर चयन के दौरान दोहराने के लिए संघर्ष. लक्षित आनुवंशिक हेरफेर में एक अन्य महत्वपूर्ण कारक जीनोमिक को लक्षित ओर से कम से कम 620 बीपी पता लगाने योग्य लक्षित एकीकरण 2 को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है के साथ कि सही समरूपता है. अनुरूपता की लंबी क्षेत्रों को लक्षित और लगभग 1,000 बीपी के डीएनए किनारों को लक्षित 1-4 एक विश्वसनीय और कारगर तरीका है का उपयोग करने की उच्च क्षमता का उत्पादन. इस कारण यह जीनोमिक लक्षित कर फ्लैंकों टी. का एक ही तनाव से उत्पन्न कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है आनुवंशिक रूप से चालाकी से किया जा रहा है कि तनाव के रूप में gondii (आरएच, प्रु). पर्याप्त अनुरूपता की कमी अक्सर एक जीनोमिक को लक्षित ओर से लक्षित एकीकरण का परिणाम है, लेकिन दूसरे नहीं कर सकते हैं. अधूरा एकीकरण या एक पीटा मा प्राप्त करने के लिए विफलतावाई भी episomal हठ की वजह से हो. इसके तत्काल बाद अभिकर्मक के बाद, को लक्षित अणुओं के सभी episomes nonintegrated कर रहे हैं, और कभी कभी को लक्षित अणुओं कई पीढ़ियों के लिए episomes के रूप में बच सकते हैं. ~ 1 KBP का लक्ष्य डीएनए किनारों का प्रयोग और पूर्व फिर से subcloning के लिए चयन के तहत परजीवी पारित करने के लिए जारी रखने के लिए अक्सर episomal दृढ़ता के साथ जुड़ी समस्याओं को हल करता है. एक पीटा मान्य है और HXGPRT मार्कर हटा दिया जाता है एक बार, जीन को निशाना बनाने की रणनीति 1-3 एक परजीवी तनाव में एकाधिक जीन विलोपन उत्पन्न करने के लिए एक दूसरा भारत सरकार पर दोहराया जा सकता है. विलोपन, प्रतिस्थापन, या टैग किए गए जीन की पीढ़ी भी अलग चयन मार्कर (bleomycin, कैट, pyrimethamine प्रतिरोधी DHFR, आदि) का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है. कैट चयन मार्कर वर्तमान प्रकार द्वितीय Δ KU80 प्रु जीनोम 1 में मौजूद है, हालांकि, इस मार्कर HXGPRT का उपयोग कर हटाया जा सकता है </उन्हें&gt; चयन प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है. हमारे हाथ में, HXGPRT चयन एक एकल प्रतिलिपि लक्षित प्रविष्टि एमपीए + एक्स मध्यम. HXGPRT में मजबूत चयन के लिए पर्याप्त है, जहां सबसे अधिक लक्षित कर कुशलता के साथ सुरक्षित और सबसे कुशल मार्कर है भी एक के लक्षित हटाने के लिए केवल वर्तमान में उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करता है 6 thioxanthine (6TX) चयन 2,3 का उपयोग कर चयन मार्कर (चित्रा 3). इस प्रकार इस प्रोटोकॉल कई लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ परिभाषित उत्परिवर्ती उपभेदों के विकास के लिए केवल वर्तमान दृष्टिकोण प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल Toxoplasma gondii की Δ KU80 उपभेदों में लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक मूल्यवान और कुशल तरीका प्रदान करता है और एक जीन, जीन के एक परिवार, या जीनोम चौड़ा कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के विश्लेषण के लिए लागू है. पिछले Δ KU80 उपभेदों 1,2 की उपलब्धता के लिए, इन तरीकों ine के कारण व्यापक रूप से व्यवहार्य नहीं थेइन तरीकों में से fficiency. नतीजतन, इस प्रोटोकॉल Toxoplasma gondii के लक्षित आनुवंशिक हेरफेर के लिए व्यापक रूप से लागू है और परजीवी जीव विज्ञान, मेजबान प्रतिक्रिया, और कार्यात्मक जीनोमिक्स पर सवालों की एक श्रृंखला के समाधान में रुचि रखते सभी जांचकर्ताओं के लिए सुलभ है.

Toxoplasma gondii कि अक्सर एक आम लाचार इंट्रासेल्युलर प्रोटोजोआ परजीवी है और लंबे समय से पशुओं और मनुष्यों 5 की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित करता है. यह इस रोगज़नक़ द्वारा अधिक से अधिक 1 अरब मनुष्य है कि वर्तमान में अनुमान लगाया गया है और लंबे समय से संक्रमित है. टी. के कारण बीमारी के महत्व के अलावा इन विट्रो विकास और उत्कृष्ट माउस मॉडल में टी. बना दिया की gondii संक्रमण, प्रयोगात्मक उपकरण, शक्तिशाली जीनोमिक्स संसाधनों 6 की बढ़ती उपलब्धता, आसानी gondii इंट्रासेल्युलर यूकेरियोटिक रोगजनकों और इस तरह के मलेरिया (प्लाज्मोडियम सपा.) और Cryptosporidiosis (क्रिप्टोस्पोरिडियम) 5,7 के रूप में घातक रोगों का कारण है कि अन्य महत्वपूर्ण Apicomplexan परजीवी के व्यापक अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल प्रणाली. एक मॉडल के रूप में जीव Toxoplasma gondii का एक महत्वपूर्ण सीमा आनुवंशिक जोड़तोड़ लक्षित ले कि संतान के अकुशल वसूली की गई है. इस समस्याओं केजीन लक्ष्यीकरण में मीटर टी. के जंगली प्रकार उपभेदों में nonhomologous पुनर्संयोजन की बहुत उच्च आवृत्ति के सापेक्ष मुताबिक़ पुनर्संयोजन के एक कम आवृत्ति की वजह से है व्यापक डीएनए अनुरूपता आनुवंशिक अध्ययन 2 में इस्तेमाल किया डीएनए अणु लक्ष्य में प्रदान की जाती है gondii भी जब. हमने हाल ही में आनुवंशिक प्रकार में nonhomologous पुनर्संयोजन के प्रमुख मार्ग अवरुद्ध, KU80 प्रोटीन 1,2 एन्कोडिंग जीन को हटाने से मैं और प्रकार द्वितीय Toxoplasma gondii के उपभेदों. मैं और प्रकार द्वितीय Δ KU80 उपभेदों सामान्य विकास दर, आकार और इन विट्रो में और vivo में इन विट्रो में tachyzoite और bradyzoite चरणों के दौरान और इन विवो में दोनों व्यवहार प्रदर्शित परिणामस्वरूप प्रकार, हालांकि, इन उपभेदों अनिवार्य रूप से एक 100% मुताबिक़ पुनर्संयोजन की आवृत्ति और इस प्रदर्शन फेनोटाइप कई यद्यपि करने के लिए कई सौ द्वारा लक्षित आनुवंशिक जोड़तोड़ की तेजी अलग इच्छित संतान की संभावना बढ़ जाती हैUSand गुना 1,2,4. हाल के समुदाय चौड़ा मैं और प्रकार द्वितीय Δ KU80 उपभेदों गति काफी ramped है प्रकार के उपयोग, विविधता, साथ ही टी में लक्षित आनुवंशिक दृष्टिकोण की सफलता दर gondii 1-4,8-13. यहाँ हम टी. के Δ KU80 उपभेदों में लक्षित जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन, और जीन टैगिंग के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल का वर्णन gondii. हम डिजाइन और मज़बूती से Toxoplasma gondii की Δ KU80 उपभेदों में विशिष्ट जीन या आनुवंशिक loci के लिए आनुवंशिक जोड़तोड़ लक्षित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

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Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

यहाँ हम प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय का उपयोग करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट<em&gt; Δku80</emके&gt; उपभेदों<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; कुशलतापूर्वक कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए लक्षित जीन विलोपन और जीन प्रतिस्थापन उत्पन्न करने के लिए.

में आनुवंशिक हेरफेर<em&gt; Δku80</emके कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए&gt; खींच<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

उच्च शुद्ध प्राप्त Toxoplasma gondii एक असंतत सीज़ियम क्लोराइड ढाल द्वारा Oocysts

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

सक्रिय अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज और Bradyzoite स्थितियां में Toxoplasma gondii पुटी दीवार संरचना

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear चूहे के खिलाफ पूर्व परिभाषित टी सेल रिसेप्टर specificities के साथ Toxoplasma gondii SCNT के माध्यम से प्राप्त

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

डीएनए की फिंगरप्रिंटिंग माइकोबैक्टीरियम leprae</emटुकड़ा लंबाई विश्लेषण (FLA) -> चर संख्या मिलकर दोहराएँ (VNTR) का प्रयोग खींच

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

एक जेनेटिक पृथक करने के लिए स्क्रीन Toxoplasma gondii मेजबान सेल निकास म्यूटेंट

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

में फॉरवर्ड जेनेटिक प्रयास<em&gt; क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent बैक्टीरिया का उपयोग रीयल टाइम में एक तीव्र माउस निमोनिया मॉडल में न्यूमोकोकल विषैलापन कारकों के प्रभाव के बाद

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

में माइलॉयड कोशिकाओं गतिशीलता की वास्तविक समय इमेजिंग<em&gt; Apc<sup&gt; न्यूनतम / +</sup</em&gt; ट्यूमर आंतों डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

समय-समय पर एसिड शिफ़ धुंधला के साथ परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में ग्लाइकोजन का पता लगाने के

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

फॉरवर्ड जेनेटिक्स पहचानें मैक्रोफेज का प्रयोग स्क्रीन<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; जीन महत्वपूर्ण प्रतिरोध करने के लिए IFN-γ-निर्भर सेल स्वायत्त प्रतिरक्षण

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...