Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del NIH per DJB (AI041930, AI073142, AI075931 e AI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui forniamo un protocollo per genica mirati ed efficaci in Δ ku80 parassita ceppi per permettere il recupero efficiente di progenie geneticamente manipolata che possiedono delezioni geniche mirate, sostituzioni geniche e / o geni marcati. L&#39;esecuzione sequenziale di questi metodi fornisce un approccio affidabile per l&#39;isolamento di mutanti parassita che contengono manipolazioni genetiche mirate singoli o multipli 1-3. Mentre la generazione di una delezione mirata dipende da molteplici fattori, l&#39;uso del ceppo ku80 Δ con la strategia e protocollo presentato aumenta notevolmente l&#39;efficienza e la facilità di fare ceppi mutanti ben definiti di T. gondii per studi di genomica funzionale. Il genoma di T. gondii durante le fasi asessuali è aploidi. Pertanto vantaggi di fare quando si pianifica di eliminare un gene è il gene che non deve essere essenziale in vitro. Tuttavia, l&#39;efficienza di targeting gene ko in Δ ku80 ceppi è estremamente elevata, e questo permette l&#39;isolamento di ceppi mutanti con tassi di replica significativamente compromessa. Se un gene mirato è essenziale, parassiti spesso cessano di replicare durante la selezione. Un altro fattore critico mirata manipolazione genetica è quella perfetta omologia con almeno 620 bp del fianco di mira genomico è necessaria per ottenere integrazioni mirate rilevabili 2. Regioni più lunghi di omologia producono elevate efficienze di targeting e il targeting utilizzando fianchi di DNA di circa 1.000 bp è un metodo affidabile ed efficiente 1-4. Per questo motivo è importante che genomiche fianchi di targeting sono generati dallo stesso ceppo di T. gondii (RH, Pru) come il ceppo che viene geneticamente manipolato. Mancanza di sufficiente omologia può spesso provocano la integrazione mirata di un fianco di targeting genomico, ma non l&#39;altro. Integrazione incompleto o mancato ottenimento di un ma koy anche essere dovuto alla persistenza episomiale. Subito dopo la trasfezione, tutte le molecole di targeting sono episomi non integrati, e qualche volta le molecole di targeting può persistere come episomi per molte generazioni. Utilizzando bersaglio fianchi di DNA di ~ 1 Kbp e continuando a passare i parassiti sotto la selezione prima di ri-subcloning risolve spesso i problemi connessi con la persistenza episomiale. Una volta che un knockout è convalidata e il marcatore HXGPRT viene rimosso, la strategia di targeting gene può essere ripetuta su un secondo GOI di generare più gene delezioni in un singolo ceppo parassita 1-3. La generazione di delezioni, sostituzioni, o geni con tag può anche essere realizzato utilizzando diversi marcatori selezionabili (bleomicina, CAT, pirimetamina resistente DHFR, ecc.) Sebbene il marcatore selezionabile CAT attualmente è presente nel tipo II Δ ku80 Pru genoma 1, questo marcatore può essere rimosso usando il HXGPRT </em&gt; protocollo di selezione descritti qui. Nelle nostre mani, la selezione HXGPRT è il più sicuro e il marcatore più efficace con la più alta efficienza di mira in cui una singola copia di inserimento mirato è sufficiente per la selezione robusta nel MPA + X medie. HXGPRT fornisce anche l&#39;approccio unico momento utile per l&#39;eliminazione mirata di un marcatore selezionabile (Figura 3) usando 6-thioxanthine (6TX) Selezione 2,3. Così questo protocollo fornisce l&#39;unica attuale approccio per lo sviluppo di ceppi mutanti definiti con diverse manipolazioni genetiche mirate. Questo protocollo fornisce un metodo valido ed efficace per la manipolazione genetica mirata a Δ ku80 ceppi di Toxoplasma gondii e si applica all&#39;analisi di un singolo gene, una famiglia di geni, o genoma studi di genomica funzionale. Prima della disponibilità di ceppi Δ ku80 1,2, questi approcci non erano ampiamente possibile a causa della ineFficiency di questi metodi. Di conseguenza, questo protocollo è ampiamente applicabile per mirati manipolazione genetica di Toxoplasma gondii ed è accessibile a tutti i ricercatori interessati ad affrontare una serie di domande sulla biologia dei parassiti, risposta dell&#39;ospite, e la genomica funzionale.

Toxoplasma gondii è un comune protozoo parassita intracellulare obbligato che spesso e cronicamente infetta una vasta gamma di animali e gli esseri umani 5. Si stima che oltre 1 miliardo di esseri umani sono attualmente e cronicamente infettati da questo agente patogeno. Oltre all&#39;importanza di malattia causata da T. gondii infezione, la crescente disponibilità di strumenti sperimentali, potenti risorse genomica 6, la facilità di crescita in vitro e di eccellenti modelli murini hanno reso T. gondii un sistema modello di punta per il più ampio studio di patogeni intracellulari eucariotiche e altri parassiti Apicomplexa significative che causano malattie devastanti come la malaria (Plasmodium sp.) e Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7. Una limitazione significativa di Toxoplasma gondii come organismo modello è stato il recupero inefficiente di progenie che trasportano mirato manipolazioni genetiche. Questo problem Il targeting gene è causa di una bassa frequenza di ricombinazione omologa rispetto alla molto alta frequenza di ricombinazione non omologa in ceppi di T. wild-type gondii anche quando ampia omologia DNA è fornita in DNA molecole bersaglio utilizzati negli studi genetici 2. Abbiamo recentemente geneticamente bloccato la principale via di ricombinazione non omologa nel tipo I e tipo II ceppi di Toxoplasma gondii eliminando il gene che codifica la proteina 1,2 KU80. Il tipo risultante I e tipo II ku80 ceppi Δ tassi di sviluppo normale, dimensione e comportamenti sia in vitro che in vivo durante tachizoite e fasi bradyzoite in vitro e in vivo, tuttavia, questi ceppi presentano essenzialmente una frequenza di 100% di ricombinazione omologa e questo fenotipo aumenta la probabilità di isolare rapidamente progenie desiderato di manipolazioni genetiche mirate da alcune centinaia ad alcune thoUSand volte 1,2,4. Recenti comunità a livello di impiego di tipo I e di tipo II Δ ku80 ceppi ha notevolmente intensificato il ritmo, la varietà, così come il tasso di successo di approcci genetici mirati a T. gondii 1-4,8-13. Qui si descrive un protocollo completo per l&#39;eliminazione mirata del gene, la sostituzione del gene, e tagging gene in Δ ku80 ceppi di T. gondii. Dimostriamo come progettare e affidabile indirizzare manipolazioni genetiche a specifici geni o loci genetici nel Δ ku80 ceppi di Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Manipolazione genetica mirata mediante ricombinazione omologa è il metodo di scelta per analisi genomica funzionale per ottenere una vista dettagliata della funzione del gene e fenotipo (s). Lo sviluppo di ceppi mutanti con delezioni, mutazioni geniche mirate mirati, funzione genica completata, e / o geni targhetta fornisce potenti strategie per colmare funzione genica, in particolare se queste manipolazioni genetiche possono essere efficacemente mirati al locus del gene di interesse utilizzando mediata dalla doppia integrazione attraversare ricombinazione omologa. A causa di tassi molto elevati di ricombinazione non omologa, analisi genomica funzionale di Toxoplasma gondii è stata precedentemente limitata dalla mancanza di metodi efficienti per il targeting gene delezioni e sostituzioni di geni per specifici loci genetici. Recentemente, abbiamo abolito la principale via di ricombinazione non omologa nel tipo I e tipo II ceppi di T. gondii eliminando il gene encoding proteine ​​1,2 KU80. I ceppi Δku80 comportano normalmente durante tachizoite (acuta) e bradyzoite (cronici) Ciclo in vitro e in vivo e mostrano essenzialmente una frequenza di 100% di ricombinazione omologa. Le ku80 ceppi Δ rendono studi di genomica funzionale realizzabile sul singolo gene nonché sulla scala genoma 1-4. Qui riportiamo i metodi per l&#39;utilizzo di tipo I e di tipo II Δku80Δhxgprt ceppi per avanzare gene strategie selettive a T. gondii. Delineiamo metodi efficienti per la generazione di delezioni geniche, sostituzioni di geni, ei geni taggati con inserimento mirato o la cancellazione del fosforibosiltransferasi (HXGPRT) marcatore ipoxantina-xantina-guanina. Il gene descritto rivolti protocollo può essere utilizzato in una varietà di modi in Δku80 ceppi per avanzare analisi funzionale del genoma parassita e per sviluppare ceppi singoli che portanomultipla mirato manipolazioni genetiche. L&#39;applicazione di questo metodo genetico e successivi test fenotipici rivelerà aspetti fondamentali e unici della biologia di T. gondii e relativi agenti patogeni umani significativi che provocano la malaria (Plasmodium sp.) e cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Un modello dettagliato è fornito per la costruzione di un plasmide di targeting per eliminare un gene, compreso il posizionamento di siti di enzimi di restrizione e la generazione dei primer che facilitano il targeting genetico e convalida di gene targeting, così come la costruzione plasmide per la successiva eliminazione di HXGPRT in un processo a singola fase (Figure 1A-C, Figura 2A, Figura 3A). Uno schema di massima è presentato per fare una delezione mirata gene (Figura 2A), le coppie di primer utilizzati per convalidare l&#39;eliminazione di un knockout, per esempio, di tipo I rop18 (Figura 2B), e risultati rappresentativi della convalida PCR sono riportati (Figura 2C). Questo risultato rappresentativo è mostrato per illustrare la gamma dei risultati ottenibili in loci genetici che sono relativamente difficili da bersaglio. Un gene delezione mirata successo comporterà l&#39;assenza del gene di ateresse prodotto di PCR (PCR 1), la presenza del 3 &#39;genomica fianco di targeting (PCR2), e la presenza del marcatore selezionabile HXGPRT adeguatamente integrato tra il 5&#39; e fianchi rivolti genomiche 3 &#39;che definiscono la cancellazione (PCR3 e pCR4) . Cloni 3, 4, 5, 6, 8, 9, e 11 vengono convalidati delezioni geniche mirate (KO), dove HXGPRT ha sostituito il GOI (Figura 2C). Un clone che non contiene un gene delezione può essere rappresentata da una varietà di modelli striature. Tipicamente, un clone senza gene delezione rispecchierà il ceppo parentale (pattern parentale) con bande osservati per PCR1 e PCR2, ma non per PCR3 o pCR4 come visto per i cloni 1 e 2 (Figura 2C). Questo &quot;modello genitoriale&quot; nasce da alcuni meccanismi potenziali. Di tanto in tanto, MPA parassiti selezionati resistenti portano non integrati episomi persistenti del pΔGOI rivolte plasmide, e notiamo che la continua selezione spesso costringe questi episomida integrare. Osserviamo anche alcuni retroscena rara nel tipo I Δ ku80 ceppo a causa di integrazione non intenzionale del pΔGOI mira plasmide, che contiene un HXGPRT cDNA espresso tramite DHFR 5 &#39;e 3&#39; elementi del promotore, in nessuna locus DHFR o nel HXGPRT parzialmente cancellato locus 14. Anche se questo è un evento raro integrazione mirata, non è stata l&#39;integrazione prevista e serve come un punto chiave da ricordare nella progettazione di qualsiasi strategia di sostituzione del gene. Omologia DNA superiore a 120 bp effettuate sul tuo pΔGOI mira plasmide può fornire un sito alternativo per la ricombinazione in Δ ku80 2 ceppi che potrebbero dare indietro un fondo indesiderato. Nel tipo II Pru Δ ku80 ceppo questo sfondo è ridotto o inesistente rispetto al tipo I, perché il marcatore selezionabile HXGPRT si basa su sequenze di tipo I che presentano polimorfismi nucleotidici se confrontato con il DNA di tipo II cheriduce notevolmente questa rara esperienza in esperimenti che utilizzano il tipo II Pru Δ ku80 ceppo 1. Se un locus genico è essenziale (non possono essere eliminati), o ha un gene estremamente bassa di mira frequenza al locus, o se persiste [non integrati] episomi non vengono facilmente eliminati attraverso la crescita e la selezione, questo modello genitoriale dominerà il pattern osservato in MPA cloni resistenti. In alternativa, la molecola di DNA di targeting si osserva talvolta ad integrare a solo il 5 &#39;o 3&#39; genomica fianco targeting e una banda viene osservata sia per PCR3 o pCR4 (ma non entrambi) insieme PCR1 e PCR2 come visto per il clone 10 (5 &#39;integrazione) e clone 7 (3&#39; integrazione) (Figura 2C). Questi modelli suggeriscono infrequente il verificarsi di un singolo croce sopra integrazione del plasmide mira al locus che integra HXGPRT ma questa integrazione mirata non elimina il gene di interesse. Questo modello (corsie 7 e 10 in Figura 2C) emphasizes la necessità di riferire dati PCR per verificare che l&#39;integrazione mirata verificato anziché un&#39;unica omologa attraversare e un secondo non omologa integrazione della molecola targeting. Raramente, osserviamo un misto genetico rappresentato da clone 12 (Figura 2C) che rappresenta sia un modello genitoriale e un modello di eliminazione mirata. Questo modello deriva probabilmente in occasione di due genotipi parassite che sono presenti nella stessa posizione in un ben clonazione. Viene mostrato un schema generale per la rimozione di HXGPRT da Δ ku80Δgoi :: HXGPRT eliminare HXGPRT dal ceppo (Figura 3A). La coppia di primer utilizzato per convalidare la rimozione di HXGPRT da ku80 Δ Δ gra2 :: HXGPRT (Figura 3B) amplifica un unico ~ 1,2 Kbp banda in PCR5 come visto nella cloni 4, 7, 9, 11 e 12 (Figura 3C). Se HXGPRT non viene rimosso dal locus, a ~ 3.Si osserva 4 banda Kbp (cloni 1, 2, 3, 6, 8, 10, e il controllo dei genitori). Diversi meccanismi agiscono per rendere la rimozione di HXGPRT (6TX selezione) più impegnativo e meno efficiente l&#39;integrazione di HXGPRT (MPA + X selezione). Selezione MPA è semplicemente più efficiente di 6TX selezione 14,16. Inoltre, sono necessari alti livelli di espressione HXGPRT per la selezione 6TX che per MPA selezioni 16,24. Di conseguenza, le mutazioni che possono ridurre l&#39;attività dell&#39;enzima HXGPRT o mutazioni o cambiamenti epigenetici che riducono il livello di espressione di HXGPRT al locus di un gene potenzialmente in grado di abolire l&#39;efficacia della selezione 6TX. Anche con queste sfide di selezione 6TX, il tasso di successo della selezione 6TX in Δ ku80 ceppi è superiore del 90% al primo tentativo 1-3. Viene mostrato un modello generale di codifica C-terminale diretto di geni codificanti proteine ​​(Figura 4). Questoschema utilizza integrazione diretta tramite doppia croce sopra ricombinazione omologa di HXGPRT 3 &#39;del gene etichettato e impiega anche strategie convalida analoghe a quelle sopra descritte. Quando un gene è sospettato di essere un gene essenziale questo può essere verificata utilizzando una seconda trasfezione con un isolato indipendente di targeting DNA plasmidico. Metodi alternativi, come i regimi per l&#39;espressione genica regolata, sono a disposizione per ulteriori verificare se un gene è essenziale 25. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figura 1. Presentazione del progetto di un DNA di targeting plasmide. Un. Schema per la progettazione di sovrapposizione primer utilizzati per la PCR amplifica il 5 &#39;e 3&#39; fianchi di destinazione con 33 sovrapposizioni bp per la navetta vettore pRS416 e cassette minigene HXGPRT. Primer raffigurati nello schema eranoutilizzato per generare il 5 &#39;e 3&#39; fianchi bersaglio di pΔROP18 10. B. Strategia generale per la progettazione di una molecola di DNA di targeting. La spina dorsale della pΔGOI è il pRS416 navetta vettore contenente uracile (URA) e ampicillina (AMP) marcatori selezionabili. Inserita in pRS416 è un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA bersaglio fianco amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni per la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando i primer F1 e R1, un ~ 1 Kbp 3&#39; del DNA fianco bersaglio viene amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni di la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando i primers F2 e R2 e la cassetta minigene HXGPRT. I seguenti enzimi di restrizione unici siti digest sono aggiunti i primer: RE.X (sito di restrizione enzimatica taglio X) nel primer F1 per tagliare il plasmide all&#39;estremità 5 &#39;estremità del 5&#39; DNA bersaglio fianco, RE.Y in R2 Primer per tagliare il plasmide alla &#39;fine del 3&#39; del DNA bersaglio 3 affiancare e RE.Z nei primers R1 e F2 di asportare il HXGPRT mincassette igene. C. sequenze dei primer utilizzati per generare il costrutto di mira per la cancellazione di rop18. Le regioni in grassetto corrispondono a T. gondii sequenza genomica, e le regioni nonbold corrispondono ai siti degli enzimi di restrizione e sequenze che si sovrappongono con pRS416 e la cassetta minigene HXGPRT. La coppia di primer HX_F e HX_R amplifica il HXGPRT cassetta minigene 14. Primer letti da 5 &#39;a 3&#39;. Tabella adattata da Fentress et al 10. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figura 2. Panoramica del protocollo per la delezione di un gene utilizzando HXGPRT. Un. Disruption di un MOL nel ceppo Δ ku80Δhxgprt da un doppio incrocio evento di ricombinazione omologa con un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA bersaglio fianco e un ~ 1 Kbp 3&#39; del DNA bersaglio fianco sul pΔGOI plasmide. Una strategia di PCR utilizzando PCR1, PCR2, PCR3 e pCR4 (non in scala) e &#39;stato che permette la verifica genotipo di convalidare cloni con l&#39;integrazione mirata di HXGPRT e delezione del locus GOI. B. coppie di primer Rappresentante progettato per convalidare l&#39;eliminazione della rop18 . ROP18_DF e ROP18_DR amplificano PCR1, ROP18_ExF e ROP18_CxR amplificano PCR2, ROP18_CxF e DHFR_CxR amplificano PCR3 e DHFR_CxF e ROP18_CxR amplificare pCR4 (Figura 2A). Primer letti da 5 &#39;a 3&#39;. Tabella adattata da Fentress et al 10. C. I risultati rappresentativi di validazione di una mirata delezione del gene (rop18) utilizzando HXGPRT. Dopo la trasfezione di plasmidi pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt e selezione in MPA +X, MPA + X cloni resistenti sono stati saggiati per la cancellazione di rop18. Ceppo parentale Il controllo è positivo per la PCR 1 (~ 400 bp) e la PCR 2 (~ 650 bp) del prodotto e negativo per la PCR 3 (~ 1.200 bp) e la PCR 4 (~ 1.300 bp) del prodotto. Una mirata GOI knockout è positivo per i PCR2, PCR3 e pCR4 prodotti ed è negativo per la PCR 1 prodotto (vedere la Figura 2A). Visualizzati sono pannelli rappresentativi dei risultati di PCR1 e PCR2 (pannello superiore), PCR3 (pannello centrale), e pCR4 (pannello inferiore). Cloni 3, 4, 5, 6, 8, 9 e 11 mostrano il corretto pattern di bande di PCR 1, PCR2, PCR3 e pCR4 che definisce un evento gene delezione mirata nel clone. Cloni 1, 2, 7, 10 e 12 non sono delezioni geniche, e corrispondono ad altri potenziali risultati rappresentativi. (C = ceppo di controllo parentale Δ ku80Δhxgprt, M = segnataglie). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figura 3. Panoramica del protocollo per la ri-mira il gene di interesse a cancellare HXGPRT. A. Strategia per la rimozione del marcatore selezionabile HXGPRT da un doppio incrocio evento di ricombinazione omologa nel ceppo Δ ku80Δgoi :: HXGPRT usando un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA bersaglio fianco e un ~ 1 Kbp 3&#39; del DNA bersaglio fianco sul pΔGOIc plasmide. La strategia PCR per la verifica genotipo è raffigurato con una coppia di primer di saggio per un prodotto di PCR (PCR5) che attraversa la delezione (non in scala). B. Una coppia rappresentante Primer progettato per convalidare la rimozione del marcatore selezionabile HXGPRT dal gra2 locus nel ceppo Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primer GRA2 _CLF e GRA2_CxR amplificano PCR5. Primer<html> leggere da 5 &#39;a 3&#39; del pannello. C. Rappresentante di cloni 6TX resistenti che possono essere ottenuti a seguito di trasfezione pΔGOIc plasmide in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT e selezione in 6TX. Cloni 4, 7, 9, 11 e 12 mostrano il corretto pattern di bande di PCR5 che corrisponde alla delezione mirata del marcatore HXGPRT (~ 1,2 Kbp prodotto che abbraccia &#39;al fianco con leggera sovrapposizione con il 5&#39; 3 il fianco e all&#39;esterno 3 &#39; fianco). Cloni 1, 2, 3, 6, 8, e 10 (questa banda è luce) rappresentano il pattern di bande atteso di circa ~ 3,4 kbp corrispondente al clone genotipo parentale, anche se questi cloni mostravano un grado di resistenza al 6TX quella ammessa la loro selezione (questo fenotipo può occasionalmente sorgere spontaneamente da arresto di espressione HXGPRT (vedi nota a protocollo 2.1 (punto 8), e la sezione Risultati Rappresentante). (C = ceppo di controllo parentale Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = segnataglie).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figura 4. Progettazione di una molecola di DNA di targeting per contrassegnare il C-terminale di una proteina. La strategia si basa sulla capacità del marcatore HXGPRT di funzionare anche come un 3 &#39;regione regolatoria a valle. La spina dorsale della pΔGOItag è il pRS416 navetta vettore contenente uracile (URA) e ampicillina (AMP) marcatori selezionabili. Inserita in pRS416 è un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA bersaglio fianco amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni per la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando il Fgoi e rTag primer, un ~ 1 Kbp 3&#39; del DNA fianco bersaglio viene amplificato dal DNA genomico con sovrapposizioni di la cassetta minigene HXGPRT e pRS416 utilizzando la F2 e R2primer e la cassetta minigene HXGPRT. Il 5 &#39;DNA bersaglio fianco sostituisce il codone di terminazione con il tag (HA, Myc, His, ecc) seguita da un codone di terminazione sostituzione. MPA + X selezione integra il tag C-terminale ed un HXGPRT valle, e sposta il 3 &#39;UTR ad una posizione dopo il marcatore HXGPRT. I seguenti enzimi di restrizione unici siti digest sono aggiunti i primer: RE.X (sito di restrizione enzimatica taglio X) nel primer Fgoi per tagliare il plasmide all&#39;estremità 5 &#39;estremità del 5&#39; DNA bersaglio fianco, e RE.Y nella Primer R2 per tagliare il plasmide alla &#39;fine del 3&#39; del DNA 3 fianco bersaglio, e RE.Z nel rTag primer e F2 per asportare la cassetta minigene HXGPRT all&#39;impiego per la costruzione del plasmide di riorientamento di locus del gene etichettato eliminare il marcatore HXGPRT da ristabilire la collocazione del 3 &#39;UTR.

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Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Qui riportiamo un metodo per l&#39;utilizzo di tipo I e tipo II<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi di<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Per generare in modo efficiente delezioni geniche mirate e sostituzioni del gene per l&#39;analisi genomica funzionale.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

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