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<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここでは、対象となる遺伝子欠失、遺伝子の交換、および/ ​​またはタグ付けされた遺伝子を持っている遺伝子操作子孫の効率的な回収を可能にするためにΔKu80が寄生虫株にターゲティング効率的な遺伝子のためのプロトコルを提供する。これらのメソッドの逐次実行は1-3単一または複数の標的遺伝子操作を含む寄生虫変異体を単離するための信頼性のあるアプローチを提供します。ターゲット削除の世代が複数の要因に依存しながら、提示戦略とプロトコルΔKu80が株の使用が大幅にTの正確に定義された変異株の作製効率と使いやすさを向上させ機能的ゲノム研究のためのトキソプラズマ 。 Tのゲノム無性段階でトキソプラズマは半数体である。したがって遺伝子を削除することを計画したときにするための考慮事項は、遺伝子がin vitroで不可欠であってはならないということです。それにもかかわらず、厳しく監督の効率Ku80が Δ株における影の遺伝子ノックアウトは非常に高く、これが著しく損なわ複製速度を有する変異株の単離を可能にする。標的遺伝子が不可欠である場合には、寄生虫はしばしば選択時に複製することをやめる。標的遺伝子操作で別の重要な要因は、ゲノム標的側面 ​​の少なくとも620塩基対とその完璧な相同性は2検出ターゲット統合を得るために必要とされています。同性の長い地域約1,000塩基対の標的DNAの脇腹を標的とし、使用して、より高い効率を生み出す信頼性と効率的なアプローチ1-4です。このような理由からゲノムターゲティングフランクがT.の同じ株から生成されることが重要である遺伝的に操作されている株とトキソプラズマ （RH、プルデンシャル）。十分な相同性の欠如は、しばしば1ゲノム標的脇腹の目標と統合になりますが、他のことはできません。不完全な統合やノックアウトMAを取得するために失敗yはまたエピソーム永続に起因する。すぐにトランスフェクション後、標的分子のすべてがエピソームを非統合され、時には標的分子は、多くの世代のためにエピソームとして存続することができます。 KBP再サブクローニングする前に選択の下に寄生虫を渡すために継続〜1の標的DNAの両サイドを使用すると、頻繁にエピソーム永続に関連する問題を解決します。 ノックアウトが検証されるとHXGPRTマーカーが削除されると、遺伝子ターゲティング戦略は1-3単一の寄生虫株で複数の遺伝子欠失を生成する第二GOIに繰り返すことができます。欠失、置換、またはタグ遺伝子の発生は、異なる選択可能なマーカー（ ブレオマイシン、CAT、ピリメタミン耐性DHFR等）を使用することによって達成することができる。 CAT選択可能なマーカーは、現在Ⅱ型ΔKu80がプルデンシャルゲノム1で存在しているが、このマーカーはHXGPRTを使用して除去することができます</em&gt;を選択プロトコルは、ここで説明する。私たちの手で、HXGPRT選択が単一コピー対象と挿入がMPA + X培地。HXGPRTで堅牢な選択のための十分である最高ターゲティング効率が最も安全で効率的なマーカーでは、またのターゲット削除のため、現在有用なアプローチを提供しています6 -チオキサンチン（6TX）選択2,3を使用して選択可能なマーカー（ 図3）。したがって、このプロトコルは、複数のターゲット遺伝子操作で定義された変異株を開発するための唯一の現在のアプローチを提供します。 このプロトコルは、 トキソプラズマのΔKu80が株で標的遺伝子操作のための貴重かつ効率的な方法を提供し、単一の遺伝子、遺伝子の家族、またはゲノムワイドな機能ゲノム研究の解析に適用することができる。 ΔKu80が株の可用性1,2に先立ち、これらのアプローチが原因伊根に広く現実的ではありませんでしたこれらのメソッドのfficiency。したがって、このプロトコルは、 トキソプラズマの標的遺伝子操作のために広く適用可能であり、寄生虫学、ホストの応答、および機能ゲノミクスに関する質問の範囲に対処するに興味を持ってすべての研究者にアクセス可能である。

トキソプラズマは、しばしば一般的な偏性細胞内寄生原虫であり、慢性的に動物と人間5の広い範囲に感染します。これは病原体によって10億以上の人間が現在であることを推定して慢性的に感染している。 T.によって引き起こされる疾患の重要性に加えてトキソプラズマ感染症、実験的なツール、強力なゲノム資源6の可用性の向上は、in vitroでの成長と優れたマウスモデルでの容易T.を作ったトキソプラズマ細胞真核生物病原体や、マラリア（ マラリアのsp。）とクリプトスポリジウム（ クリプトスポリジウム ）5,7として壊滅的な病気を引き起こす他の重要アピコンプレクサ原虫の広範な研究のための主要なモデルシステム。モデル生物としてのトキソプラズマの重要な制限は、遺伝子操作をターゲット運ぶ子孫の非効率的な回復となっています。これのproble遺伝子ターゲティングでmは、T.、野生型株における非相同的組換えの非常に高い周波数に対して相同組換えの低周波によるものである広範なDNA相同性が遺伝学的研究2で使用したDNA標的分子に設けられていても原虫 。 我々は最近、遺伝子組み換え型の非相同組換えの主要な経路をブロックKu80がタンパク質1,2をコードする遺伝子を削除して、IとII型トキソプラズマの株。 I型およびIIΔKu80が菌株はin vitroおよびin vivoでタキゾイトとブラディゾイトの段階でインビトロおよびインビボの両方の正常な成長率、大きさ及び挙動を示す結果の型が、これらの株は、相同組換えの本質的に100％の周波数を示し、この表現型は、いくつかのカン​​トーに数百の標的に遺伝子操作の急速に分離希望の子孫の可能性が高くなりますusand倍1,2,4。最近のコミュニティ全体のIとII型ΔKu80が株がペースアップする大幅上昇持つ型の使用、様々ならびにT.におけるターゲット遺伝子アプローチの成功率トキソプラズマ1-4,8-13。ここでは、TのΔKu80が株で、標的遺伝子欠失、遺伝子置換、遺伝子タギングのための包括的なプロトコルを記述するトキソプラズマ 。我々はデザインと確実にトキソプラズマのΔKu80が株で特定の遺伝子または遺伝子座に遺伝子操作をターゲットにする方法を示します。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

相同組換えを利用した標的遺伝子操作は、遺伝子機能と表現型（単数または複数）の詳細図を得るための機能的なゲノム解析のための選択方法である。標的遺伝子の欠失、標的突然変異、補完遺伝子の機能、および/またはタグ付けされた遺伝子を有する変異株の開発は、これらの遺伝子操作を効率的に二重によって媒介積分を用いて、目的の遺伝子座を標的とすることができる場合は特に、遺伝子機能に対処するための強力な戦略を提供する相同組換えを渡る。 非相同的組換えの非常に高いレートの変動により、 トキソプラズマ原虫のゲノム解析の機能は、以前は、特定の遺伝子座に遺伝子欠失、遺伝子の交換を標的とする効率的な方法が存在しないことによって制限されている。最近、我々はI型とII型Tの株で非相同組換えの主要な経路を廃止遺伝子encodinを削除してトキソプラズマG Ku80がタンパク質1,2。 Δku80株は、in vitroおよびin vivoでタキゾイト（急性）とブラディゾイト（慢性）段階で正常に動作し、実質的に相同組換えの100％の頻度を示す。 ΔKu80が株は単一の遺伝子で同様のゲノムスケール1-4で機能的なゲノム研究が実現可能に。 ここでは、T.でのアプローチを対象とした遺伝子を進めるためにタイプIとタイプIIΔku80Δhxgprt株を使用する方法を報告するトキソプラズマ 。私たちは、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HXGPRT）選択マーカーの標的挿入や欠失により遺伝子欠失、遺伝子の交換、およびタグの遺伝子を生成するための効率的な方法を概説する。プロトコルを対象の遺伝子は、寄生虫のゲノムの機能解析を進めるために、持ち運び単一菌株を開発するΔku80株では、様々な方法で使用することができる複数のターゲット遺伝子操作。この遺伝的方法とその後の表現型アッセイのアプリケーションがTの生物学の基本的かつユニークな側面を明らかにするトキソプラズマやマラリア（ マラリアのsp。）とクリプトスポリジウム症（ クリプトスポリジウム ） を引き起こす関連の重要なヒト病原体。

詳細なテンプレートは、制限酵素部位の配置とでHXGPRTその後の削除のための遺伝子ターゲッティング、遺伝子の検証が目標とする、ならびにプラスミド構築を促進するプライマーの生成を含む、遺伝子ターゲティングを削除するプラスミドを構築するために設けられている単一ステップのプロセス（ 図1A-C、図2Aは 、 図3A）。一般的な概略図は、例えば、標的遺伝子の欠失（ 図2A）、ノックアウトの削除を検証するために使用されるプライマーペアを作るために提示され、タイプI rop18（ 図2B）、およびPCR検証の代表的な結果が示されている（ 図2C）。この代表的な結果は、ターゲットが比較的困難である遺伝子座で得ることができる結果の範囲を例示するために示されている。正常標的遺伝子欠失ラーニング遺伝子の有無をもたらすterest PCR産物（PCR 1）、3の存在&#39;ゲノム標的脇腹（PCR2）、そして適切に5の間に統合HXGPRT選択可能なマーカーの存在&#39;と（PCR3とPCR4）削除を定義する3 &#39;ゲノム標的脇腹。クローン3、4、5、6、8、9、および11はHXGPRTは GOI（ 図2C）を置き換えて標的遺伝子の欠失（ノックアウト）が検証される。 遺伝子欠失を含まないクローンは、様々なバンドパターンで表すことができる。クローン1及び2（ 図2C）が見られるように一般的には、遺伝子欠失なしのクローンはPCR1とPCR2について観察されたバンドではなく、PCR3またはPCR4ため親株（親のパターン）をミラーします。この &quot;親のパターンは、&quot;いくつかの潜在的なメカニズムから生じる。時折、MPA耐性選択寄生虫はプラスミドターゲティングpΔGOIの非統合永続エピソームを運び、我々は継続的な選択は、多くの場合、これらのエピソームを強制することに注意してください統合することができます。我々はまた、私はΔはpΔGOIの意図しない統合のためにKu80が株はDHFR 5 &#39;および3&#39;プロモーターエレメント、DHFR遺伝子座のどちらかに、または部分的に削除されたHXGPRTに介して表現HXGPRTのcDNAを含むプラスミドターゲティング型のいくつかの珍しい背景を観察する軌跡14。このまれなイベントはターゲットの統合ですが、それは意図された統合はなかったし、任意の遺伝子置換戦略を設計する際に覚えておくべき重要なポイントとして機能します。プラスミドターゲットとするpΔGOIで運ば120塩基対よりもDNAの相同性は、望ましくないバックグラウンドをバック与えることができるΔKu80が株2組換えのための代替サイトを提供することがあります。 HXGPRT選択マーカーは、タイプII型DNAと比較した場合、塩基多型を持って、私は配列に基づいているため、II型プルデンシャルΔKu80が株ではこのような背景が減少または存在しない私を入力する比較される大幅II型プルデンシャルΔKu80がひずみ1を用いた実験では、この希少なバックグラウンドが減少。遺伝子座が不可欠である（削除できません）、または遺伝子座頻度をターゲティング極めて低い遺伝子を持っている、または永続[統合されていない]エピソームを簡単に成長し、選択を介して排泄されていない場合、この親のパターンは、MPAで観察されたパターンを支配する場合耐性クローン。また、標的DNA分子は、時には唯一の5 &#39;または3&#39;ゲノム標的脇腹とクローン10（5のために見られるようなバンドがPCR1とPCR2とともにPCR3またはPCR4（両方ではない）のどちらかのために観察さで統合することが観察される&#39;統合）とクローン7（3&#39;統合）（ 図2C）。これらのパターンはHXGPRTを統合したが、この目標との統合は、目的の遺伝子を削除しません座で標的プラスミドの統合上の単一のクロスのまれな発生を示唆している。このパターン（ 図2Cにおけるレーン7＆10）EMその目標と統合が代わりに発生したかどうかを確認するためのPCRデータを報告する必要がphasizesシングルは相同渡ると標的分子の非相同第2の積分。まれに、私たちは親のパターンとターゲット削除パターンの両方を表しているクローン12（ 図2C）で表される遺伝子混合物を観察していません。このパターンは、最も可能性が高いだけでなくクローニングで同じ場所に存在している2寄生虫の遺伝子型からの機会に発生します。 Δku80ΔgoiからHXGPRTの除去のための一般的な回路図:: HXGPRT株からHXGPRTを削除するには（ 図3A）が示されている。クローン4、図7、図9、図11、図12（ 図3C）に見られるように、ΔKu80がΔGRA2 :: HXGPRT（ 図3B）からHXGPRTの除去を検証するために使用されるプライマー対は一意でPCR5〜1.2 kbpの帯域を増幅する。 HXGPRTは軌跡〜3から削除されていない場合。4 kbpのバンドは（クローン1、2、3、6、8、10、およびペアレンタルコントロール）が観察される。いくつかのメカニズムはHXGPRTの統合（MPA + X選択）よりHXGPRTの除去（6TX選択）がより困難の少ない効率的にするために行動する。 MPAの選択は6TXセレクション14,16より単により効率的です。また、HXGPRT発現のより高いレベルは、MPAの選択16,24よりも6TX選択のために必要とされる。したがって、HXGPRT酵素活性又は突然変異または遺伝子座でのHXGPRTの発現レベルを減少させるエピジェネティックな変化を低減することができる突然変異は、潜在的に6TX選択の効果を廃止することができる。さえ6TX選択、これらの課題に、ΔKu80が株で6TX選択の成功率は1-3の最初の試みで、90％以上である。 タンパク質をコードする遺伝子の直接的なC-末端タグ付けのための一般的なスキームは、（ 図4）が示されている。このスキームはHXGPRT 3 &#39;タグ付けされた遺伝子のも上記と同様の検証戦略を採用して相同組換えを介して二重のクロスを介して直接統合を使用しています。遺伝子は、これは独立して単離されたプラスミド標的DNAと第二のトランスフェクションを使用して検証することができます必須遺伝子であることが疑われる場合。このような調節遺伝子発現のための制度などの代替の方法は、遺伝子が25必要不可欠である場合、さらに検証するために利用可能です。 <img alt="図1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> 図1。プラスミド標的DNAの設計の概要。 PCRに使用される重複プライマーを設計する。回路図pRS416シャトルベクターとHXGPRTのミニ遺伝子カセットのための33 bpのオーバーラップで5 &#39;および3&#39;ターゲット脇腹を増幅。回路図に描かれたプライマーは5 &#39;および3&#39;pΔROP1810の ​​目標フランク。ターゲティングDNA分子を設計するためB.総合的な戦略を生成するために使用される。 pΔGOIのバックボーンはpRS416シャトルベクター含むウラシル（URA）とアンピシリン（AMP）選択マーカーである。 〜1 kbpの5 pRS416に挿入&#39;F1及びR1プライマーを用いてHXGPRTミニ遺伝子カセット及びpRS416ための重なりがゲノムDNAから増幅されたDNA標的フランクは、約1 kbpの3&#39; DNA標的フランクはについての重なりで、ゲノムDNAから増幅されるHXGPRTのミニ遺伝子カセット及びF2とR2プライマーとHXGPRTのミニ遺伝子カセットを使用pRS416。次のユニークな制限酵素消化サイトはプライマーに追加されますF1プライマー中RE.X（制限酵素Xカットサイト）R2ではRE.Y、DNA標的横腹5 &#39;5&#39;末端にプラスミドをカットする消費税HXGPRTの minにR1とF2プライマーでDNA標的横腹とRE.Z 3 &#39;3&#39;末端にプラスミドを削減するプライマーrop18の削 ​​除のためのターゲティング構築物を生成するために使用igeneカセット℃のプライマー配列。 大胆な領域がTに対応原虫ゲノム配列、そして太字以外の地域はpRS416とHXGPRTのミニ遺伝子カセットと重複制限酵素部位と配列に対応する。 HX_FとHX_Rプライマー対はHXGPRTミニ遺伝子カセット14を増幅する。プライマーは、5 &#39;から3&#39;へ読み。フェントレスら 10から適応表は<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> 図2。 HXGPRTを用いた遺伝子の欠失のためのプロトコルの概要。 。Disruptionは1〜KBP 5 &#39;DNA標的脇腹と〜1 kbpの3&#39;プラスミドpΔGOIにDNA標的横腹を使って二重交差相同組換え事象によってΔku80Δhxgprt株におけるGOIの。 PCRのPCR1を使用して戦略、PCR2、PCR3、およびPCR4は（ノンスケール）GOI座の標的とHXGPRTの統合と削除をクローンを検証するために遺伝子型の検証を可能にすることが示されている。B.描写プライマー対rop18の削 ​​除を検証するために設計された。ROP18_DFとROP18_DRはPCR1、ROP18_ExFとROP18_CxRはPCR2、ROP18_CxFとDHFR_CxRがPCR4を（ 図2Aを参照）を増幅PCR3とDHFR_CxFとROP18_CxRを増幅する増幅する増幅する。プライマーは、5 &#39;から3&#39;へ読み。表はフェントレスらからHXGPRTを使っ標的遺伝子欠失（rop18）の検証の10℃の代表的な結果を適応した。MPAにおけるΔku80Δhxgprtと選択にプラスミドpΔROP18のトランスフェクション+X、MPA + X耐性クローンはrop18の削 ​​除についてアッセイした。親株コントロールPCR 3（〜1,200 BP）およびPCRのためのPCR 1（〜400塩基対）およびPCR 2（〜650 bpの）製品と負のために肯定的である4（〜1,300 BP）製品。ターゲットGOIノックアウトはPCR2、PCR3とPCR4製品の正であり、PCR 1製品に対して否定的である（ 図2Aを参照）。示さPCR1とPCR2（ トップパネル）、PCR3（ 中央パネル）、およびPCR4（ 下パネル）の結果の代表パネルです。クローン3、4、5、6、図8、図9及び図11は、クローン内の標的遺伝子の削除イベントを定義するPCR 1、PCR2、PCR3 PCR4との正確なバンドパターンを示す。クローン1、図2、図7、図10および図12は、遺伝子欠失はなく、他の潜在的な代表的な結果に対応する。 （C =ペアレンタルコントロールひずみΔku80Δhxgprt、M =サイズマーカー） <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> 図3。 HXGPRTを削除するには、興味のある再遺伝子ターゲティングのためのプロトコルの概要。ひずみΔku80Δgoiで二重交差相同組換え事象によってHXGPRT選択マーカーの除去のためのA.戦略 ::〜1 kbpの5 &#39;側DNA標的脇腹と〜1 kbpの3&#39;プラスミドpΔGOIc上のDNA標的横腹を使用HXGPRT。遺伝子型を検証するためのPCR戦略は（正確な縮尺ではない）削除をまたがるPCR産物（PCR5）するためのアッセイにプライマー対を用いて示されている。B. GRA2からHXGPRT選択マーカーの除去を検証するために設計された代表的なプライマー対ひずみΔku80Δgra2における軌跡:: HXGPRT。プライマーGRA2 _CLFとGRA2_CxRはPCR5を増幅。プライマー<html> 5 &#39;から3&#39;から読み取る。Δku80ΔgoiプラスミドpΔGOIcのトランスフェクション:: 6TXでHXGPRTと選択後に取得することができる6TX耐性クローンのC.描写パネルが。クローン4、7、9、11、12展示HXGPRTマーカーの対象と削除（〜1.2 KBPの横腹5 &#39;と若干重なると脇腹&#39; 3にまたがる製品と3外&#39;に対応PCR5の正しいバンドパターン脇腹）。クローン1、2、3、6、8、10（このバンドは光である）、これらのクローンが許容6TXに対する抵抗性の程度を示したにもかかわらず、親クローンの遺伝子型に対応する3.4 kbpの〜周りの予想されるバンドパターンを表す彼らの選択（この表現が時折（プロトコル2.1（ステップ8）でノートと代表的な結果の項を参照 ）シャットダウンHXGPRTの発現により、自発的に起こることができます（C =ペアレンタルコントロール株Δku80Δgoi:: HXGPRT、M =サイズマーカー）。w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> 図4。タンパク質のC末端にタグを対象としたDNA分子の設計。戦略はまた、3 &#39;下流調節領域として機能するHXGPRTマーカーの能力に基づいている。 pΔGOItagのバックボーンはpRS416シャトルベクター含むウラシル（URA）とアンピシリン（AMP）選択マーカーである。 DNA標的横腹ため重なってゲノムDNAから増幅された約1 kbpの5 &#39;Fgoiとrtagのプライマー、〜1 kbpの3使用HXGPRTのミニ遺伝子カセット及びpRS416ため重なってゲノムDNAから増幅したDNA標的横腹&#39;はpRS416挿入F2とR2を使用してHXGPRTミニ遺伝子カセット及びpRS416プライマーとHXGPRTのミニ遺伝子カセット。 5 &#39;DNA標的横腹、交換終止コドンに続くタグ（HA、Mycの、彼の、など）と終止コドンを置き換えます。 MPA + X選択は、C末端タグと下流HXGPRTを統合し、HXGPRTマーカーに続く位置に3 &#39;UTRに移動します。次のユニークな制限酵素消化サイトはプライマーに追加されます。FgoiプライマーでRE.X（制限酵素Xカットサイト）DNA標的横腹5 &#39;5&#39;末端にプラスミドを切断し、RE.Yにするプラスミド構築に使用する再標的にタグ付けされた遺伝子座削除するためのHXGPRTのミニ遺伝子カセット消費税にrtagのとF2プライマーでDNA標的逃げ3 &#39;3&#39;末端にプラスミド、及びRE.ZをカットするR2プライマー3 &#39;UTRの配置を復元しますHXGPRTマーカー 。

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Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

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