Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH til DJB (AI041930, AI073142, AI075931, og AI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Her gir vi en protokoll for effektiv gene targeting i Δ ku80 parasitt stammer for å muliggjøre effektiv utvinning av genetisk manipulert avkom som har målrettede genet slettinger, Gene utskiftninger, og / eller kodede gener. Den sekvensielle utførelse av disse metoder gir en pålitelig metode for isolering av parasitt mutanter som inneholder én eller flere målrettede genetiske manipulasjoner 1-3. Mens genereringen av en målrettet sletting avhenger av flere faktorer, øker bruken av Δ ku80 stamme med den presenterte strategi og protokollen i stor grad effektiviteten og lette å lage nøyaktig definerte mutante stammer av T. gondii for funksjonell genomisk studier. Genomet til T. gondii under aseksuelle stadier er haploide. Dermed oppstår et hensyn å ta når du planlegger å slette et gen er at genet ikke må være avgjørende in vitro. Likevel, effektiviteten av innsiktningenterende genet knockouts i Δ ku80 stammer er ekstremt høy, og dette gjør det mulig for isolering av mutantstammer med betydelig svekket replikering priser. Hvis en målrettet genet er viktig, parasitter ofte slutte å gjenskape under valget. En annen kritisk faktor i målrettet genetisk manipulering, er at perfekt homologi med minst 620 bp av det genomiske målretting flanke er nødvendig for å oppnå detekterbare målrettede integrasjoner 2. Lengre regioner i homologi produsere høyere effektivitet på målretting og bruker målretting DNA flankene av ca 1000 bp er en pålitelig og effektiv tilnærming 1-4. Av denne grunn er det viktig at genomisk rettet mot flankene genereres fra samme stamme av T. gondii (RH, Pru) som den belastning som blir genetisk manipulert. Mangel på tilstrekkelig homologi kan ofte resultere i at målrettet integrasjon av en genomisk målretting flanke, men ikke den andre. Ufullstendig integrering eller unnlatelse av å få en knockout may også skyldes episomal utholdenhet. Umiddelbart etter transfeksjon, er alle rettet mot molekyler ikke-integrerte episomes, og noen ganger rettet mot molekyler kan vedvare som episomes i mange generasjoner. Ved hjelp av target DNA flankene av ~ en KBP og fortsetter å passere parasitter etter valget før re-subkloning løser ofte problemer forbundet med episomal utholdenhet. Når en utstansing er validert og den HXGPRT markøren er fjernet, kan genet målrettingsstrategien gjentas på en andre GOI å generere flere genet slettinger i en enkelt parasitt stamme 1-3. Generering av overstrykninger, utskiftninger, eller tagget gener kan også oppnås ved å bruke ulike valgbare markører (bleomycin, CAT, pyrimethamine motstandsdyktig DHFR, etc.). Selv om CAT valgbar markør for tiden er til stede i type II Δ ku80 Pru genom ett, kan denne markøren fjernes ved hjelp av HXGPRT </em&gt; valg protokollen beskrevet her. I våre hender, er HXGPRT utvalg den sikreste og mest effektive markør med høyest målretting effektivitet der en enkelt-kopi målrettet innsetting er tilstrekkelig for robust valget i MPA + X medium. HXGPRT gir også den eneste tiden nyttig tilnærming for målrettet sletting av en valgbar markør (figur 3) med 6-thioxanthine (6TX) valg 2,3. Derfor er denne protokollen er den eneste nåværende tilnærming for å utvikle definerte mutantstammer med flere målrettede genetiske manipulasjoner. Denne protokollen gir en verdifull og effektiv metode for målrettet genetisk manipulasjon i Δ ku80 stammer av Toxoplasma gondii og gjelder til analyse av et enkelt gen, en familie av gener, eller genom-wide funksjonell genomisk studier. Før tilgjengeligheten av Δ ku80 stammer 1,2, var disse metodene ikke allment gjennomførbart på grunn av inefficiency av disse metodene. Derfor er denne protokollen allment gjeldende for målrettet genetisk manipulering av Toxoplasma gondii og er tilgjengelig for alle etterforskerne interessert i å ta opp en rekke spørsmål om parasitt biologi, vertsrespons og funksjonell genomforskning.

Toxoplasma gondii er en vanlig obligat intracellulær protozoan parasitt som ofte og kronisk infiserer et bredt utvalg av dyr og mennesker 5. Det er anslått at mer enn 1 milliard mennesker er i dag og kronisk infisert av dette patogenet. I tillegg til viktigheten av sykdom forårsaket av T. gondii infeksjon, økt tilgjengelighet av eksperimentelle verktøy, kraftige genomikk ressurser 6, enkel in vitro vekst og gode musemodeller har gjort T. gondii en ledende modellsystem for det bredere studie av intracellulære eukaryote patogener og andre vesentlige apicomplexan parasitter som forårsaker ødeleggende sykdommer som malaria (Plasmodium sp.) og cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7. En vesentlig begrensning av Toxoplasma gondii som modell organisme har vært ineffektiv gjenvinning av avkom som bærer målrettet genetiske manipulasjoner. Dette problemområderm i genet targeting er på grunn av en lav frekvens av homolog rekombinasjon i forhold til den meget høye frekvens av ikkehomologe rekombinasjon i villtype-stammer av T. gondii selv når omfattende DNA-homologi er gitt i DNA-mål-molekyler som benyttes i genetiske studier 2. Vi har nylig genetisk blokkert den viktigste veien for ikkehomologe rekombinasjon i type I og type II stammer av Toxoplasma gondii ved å slette genet som koder for KU80 protein 1,2. Den resulterende type I og type II Δ ku80 stammer oppviser normale vekstrater, størrelse og oppførsel både in vitro og in vivo under tachyzoite og bradyzoite stadier in vitro og in vivo, er imidlertid disse stammer oppviser en tilnærmet 100% hyppighet av homolog rekombinasjon og denne fenotype øker sannsynligheten for raskt å isolere ønsket avkom av målrettede genetiske manipulasjoner med flere hundre til flere thousand-fold 1,2,4. Nylig community-utstrakte bruken av type I og type II Δ ku80 stammer har betydelig trappet opp tempoet, variasjonen, samt suksessrate på målrettede genetiske tilnærminger i T. gondii 1-4,8-13. Her beskriver vi en omfattende protokoll for målrettet genet sletting, genet utskifting, og genet tagging i Δ ku80 stammer av T. gondii. Vi demonstrerer hvordan å designe og pålitelig målrette genetiske manipulasjoner til bestemte gener eller genetiske loci i Δ ku80 stammer av Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Målrettet genetisk manipulasjon hjelp homolog rekombinasjon er metoden for valg for funksjonell genomisk analyse for å få en detaljert visning av gen-funksjon og fenotype (s). Utviklingen av mutantstammer med målrettede genet slettinger, målrettede mutasjoner, supplert genet funksjon, og / eller kodede gener gir kraftige strategier for å løse gen-funksjon, spesielt hvis disse genetiske manipulasjoner kan være effektivt målrettet til genet locus av interesse å bruke integrering mediert ved å dobbeltklikke krysse over homolog rekombinasjon. På grunn av meget høy forekomst av ikkehomologe rekombinasjon, funksjonell analyse av genomisk Toxoplasma gondii tidligere har vært begrenset av fravær av effektive metoder for målretting genet slettinger og gen utskiftinger til spesifikke genetiske loci. Nylig avskaffet vi de store vei av ikkehomologe rekombinasjon i type I og type II stammer av T. gondii ved å slette genet encoding den KU80 protein 1,2. De Δku80 stammer oppføre seg normalt under tachyzoite (akutt) og bradyzoite (kroniske) stadier in vitro og in vivo, og oppviser en tilnærmet 100% hyppighet av homolog rekombinasjon. De Δ ku80 stammer gjør funksjonelle genomisk studier gjennomførbart på enkelt gen samt på genomet skala 1-4. Her rapporterer vi metoder for bruk av type I og type II Δku80Δhxgprt stammer å avansere gene targeting tilnærminger i T. gondii. Vi skissere effektive metoder for å generere genet slettinger, Gene utskiftninger, og tagget gener ved målrettet innsetting eller sletting av hypoxanthin-xanthine-guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) seleksjonsmarkør. Den beskrevne gene targeting protokollen kan brukes på en rekke forskjellige måter i Δku80 stammer å avansere funksjonell analyse av parasitten genomet, og for å utvikle enkle stammer som bærerflere målrettede genetiske manipulasjoner. Anvendelsen av denne genetiske metode og etterfølgende fenotypiske analyser vil avdekke fundamentale og unike aspekter av biologien til T. gondii og relaterte betydelige menneskelige patogener som forårsaker malaria (Plasmodium sp.) og cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

En detaljert mal er gitt for å konstruere et plasmid rettet til å slette et gen, herunder plassering av restriksjonsenzymseter og generering av de primere som letter genetisk målretting og validering av genet målretting, så vel som plasmid-konstruksjon for den etterfølgende sletting i et HXGPRT single-trinns prosess (figur 1A-C, figur 2A, figur 3A). En generell skjematisk er presentert for å lage en målrettet genet sletting (figur 2a), primerpar benyttet for å validere sletting av en utstansing, for eksempel, er type I rop18 (figur 2B), og representative resultater av PCR validering vist (figur 2C). Denne representanten Resultatet vises for å illustrere omfanget av resultater som kan oppnås ved genetiske loci som er relativt vanskelig å målrette. En vellykket målrettet genet sletting vil resultere i fravær av genet av iterest PCR-produkt (PCR 1), tilstedeværelse av 3&#39;-genomisk målretting flanke (PCR2), og tilstedeværelsen av den HXGPRT selekterbar markør ordentlig integrert mellom 5 &#39;og 3&#39; genomisk målretting flanker som definerer slettingen (PCR3 og PCR4) . Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 og 11 er validert målrettede genet slettinger (knockouts) hvor HXGPRT har erstattet den GOI (figur 2C). En klone som ikke inneholder et gen sletting kan representeres ved en rekke båndmønstre. Vanligvis vil en klone uten genet sletting speile foreldrenes stamme (foreldrenes mønster) med band observert for PCR1 og PCR2, men ikke for PCR3 eller PCR4 sett for kloner 1 og 2 (figur 2C). Denne &quot;foreldrenes mønster&quot; oppstår fra noen potensielle mekanismer. Av og MPA resistente utvalgte parasitter bære ikke-integrerte vedvarende episomes av pΔGOI rettet plasmid, og noterer vi at fortsatt valg ofte tvinger disse episomeså integrere. Vi har også observere noen sjeldne bakgrunn i type I Δ ku80 belastning på grunn av utilsiktet integrering av pΔGOI målretting plasmid, som inneholder et HXGPRT cDNA uttrykt via DHFR 5 &#39;og 3&#39; promoter elementer, enten i det DHFR-lokus eller inn i den delvis slettet HXGPRT locus 14. Mens denne sjeldne hendelsen er en målrettet integrasjon, var det ikke den tiltenkte integrering og fungerer som et sentralt punkt å huske når du designer et gen erstatning strategi. DNA homologi større enn 120 bp gjennomført på pΔGOI målrettingen plasmid kan gi et alternativt sted for rekombinasjon i Δ ku80 stammer to som kunne gi tilbake en uønsket bakgrunn. I type II Pru Δ ku80 belastningen denne bakgrunn er redusert eller ikke-eksisterende forhold til type I fordi HXGPRT seleksjonsmarkør er basert på type I sekvenser som har nukleotid polymorfismer sammenlignet med type II DNA somreduserer denne sjeldne bakgrunn i eksperimenter med den type II Pru Δ ku80 belastning en. Hvis et gen locus er viktig (kan ikke slettes), eller har en ekstremt lav gene targeting frekvens på locus, eller om vedvarende [ikke-integrerte] episomes er ikke lett elimineres via vekst og utvalg, vil dette foreldrenes mønster dominere mønster observert i MPA resistente kloner. Alternativt er rettet mot DNA-molekylet noen ganger observert å integrere ved bare den 5 &#39;eller 3&#39;-genomisk målretting flanke og et band er observert for enten PCR3 eller PCR4 (men ikke begge) sammen med PCR1 og PCR2 som sett for klon 10 (5 &#39;integrasjon) og klone 7 (3&#39; integrasjon) (figur 2C). Disse mønstrene foreslå sjeldne forekomsten av et enkelt kryss over integrering av målretting plasmid ved locus som integrerer HXGPRT men dette målrettet integrering slettes ikke genet av interesse. Dette mønsteret (baner 7 og 10 i figur 2C) emvekt på gjeldende behov for å rapportere PCR-data for å bekrefte at målrettet integrasjon forekom i stedet for en enkelt homolog tvers over og et andre ikkehomologe integrering av målretting molekylet. Sjelden ser vi en genetisk blanding representert ved klone 12 (figur 2C) som representerer både en foreldrekontroll mønster og en målrettet sletting mønster. Dette mønsteret mest sannsynlig oppstår av og til fra to parasitt genotyper som er til stede på det samme sted i et kloning godt. En generell skjematisk for fjerning av HXGPRT fra Δ ku80Δgoi :: HXGPRT å slette HXGPRT fra belastningen blir vist (figur 3A). Den primerpar brukes til å validere fjerning av HXGPRT fra Δ ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (Figur 3B) forsterker en unik ~ 1,2 KBP bandet i PCR5 som sett i kloner 4, 7, 9, 11 og 12 (Figur 3C). Hvis HXGPRT ikke fjernes fra locus, en ~ 3.4 KBP bandet er observert (kloner 1, 2, 3, 6, 8, 10, og foreldrekontroll). Flere mekanismer handle for å gjøre fjerning av HXGPRT (6TX utvalg) mer utfordrende og mindre effektiv enn integrering av HXGPRT (MPA + X utvalg). MPA valget er rett og slett mer effektiv enn 6TX utvalg 14,16. I tillegg er høyere nivåer av ekspresjon HXGPRT nødvendig for 6TX valg enn for MPA valg 16,24. Følgelig kan mutasjoner som kan redusere HXGPRT enzymaktivitet eller mutasjoner eller epigenetiske endringer som reduserer uttrykket nivået av HXGPRT på et gen locus potensielt avskaffe effektiviteten av 6TX utvalg. Selv med disse utfordringene i 6TX valg, er suksessraten av 6TX utvalg i Δ ku80 stammer mer enn 90% på første forsøk 1-3. Et generelt skjema for direkte C-terminal merking av protein-kodende gener er vist (figur 4). Detteordningen benytter direkte integrasjon via dobbel cross over homolog rekombinasjon av HXGPRT 3 &#39;av det kodede genet og også anvender strategier for validering lik de beskrevet ovenfor. Når et gen som er mistenkt for å være et essensielt gen Dette kan kontrolleres ved hjelp av en andre transfeksjon med et uavhengig plasmid DNA isolert målretting. Alternative metoder, slik som ordninger for regulert genekspresjon, er tilgjengelige for ytterligere å verifisere om et gen som er essensielt 25.. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figur 1. Oversikt over utformingen av en målretting DNA plasmid. A. Skjematisk for utforming overlapper primere brukes til PCR forsterke 5 &#39;og 3&#39; target flankene med 33 bp overlapper for pRS416 shuttle vektor og HXGPRT minigene kassett. Primere avbildet i skjematisk varbrukes til å generere den 5 &#39;og 3&#39; target flankene av pΔROP18 10.. B. Generell strategi for å utforme en målrettende DNA-molekyl. Ryggraden i pΔGOI er pRS416 shuttle vektor som inneholder uracil (URA) og ampicillin (AMP) valgbare markører. Satt inn pRS416 er en ~ en KBP 5 &#39;DNA-mål flanke forsterket fra genomisk DNA med overlapper for HXGPRT minigene kassett og pRS416 hjelp av F1 og R1 primere, en ~ en KBP 3&#39; er DNA-mål flanke forsterket fra genomisk DNA med omlegg for den HXGPRT minigene kassett og pRS416 bruke F2 og R2 primere og HXGPRT minigene kassett. Følgende unike restriksjonsenzymseter fordøye nettsteder er lagt til primere: RE.X (begrensning enzym X cut stedet) på F1 primer å kutte plasmidet på 5 &#39;enden av fem&#39; DNA-mål flanke, RE.Y i R2 primer for å kutte plasmidet ved 3&#39;-enden av den 3&#39;-DNA-mål flanke og RE.Z i R1-og F2-primere å skjære den HXGPRT minigene kassett. C. Primer sekvenser som brukes til å generere målretting konstruere for sletting av rop18. Den dristige regionene tilsvarer T. gondii genomisk sekvens, og nonbold regionene tilsvarer restriksjonsenzymseter og sekvenser som overlapper med pRS416 og HXGPRT minigene kassett. Den HX_F og HX_R primerpar forsterker HXGPRT minigene kassett 14. Primere lese fra 5 &#39;til 3&#39;. Tabell tilpasset fra Fentress et al 10. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figur 2. Oversikt over protokollen for sletting av et gen ved hjelp HXGPRT. A. Disruption av en GOI i Δ ku80Δhxgprt belastningen ved en dobbel crossover homolog rekombinasjon hendelse ved hjelp av en ~ en KBP 5 &#39;DNA-mål flanke og en ~ en KBP 3&#39; DNA-mål flanke på plasmid pΔGOI. En PCR strategi ved hjelp PCR1, PCR2, PCR3, og PCR4 (ikke i målestokk) er vist som gjør at genotype verifisering for å validere kloner med målrettet integrering av HXGPRT og sletting av GOI locus. B. Representative primer parene utviklet for å validere sletting av rop18 . ROP18_DF og ROP18_DR forsterke PCR1, ROP18_ExF og ROP18_CxR forsterke PCR2, ROP18_CxF og DHFR_CxR forsterke PCR3 og DHFR_CxF og ROP18_CxR forsterke PCR4 (se figur 2A). Primere lese fra 5 &#39;til 3&#39;. Tabell tilpasset fra Fentress et al 10. C. Representative resultater av validering av en målrettet genet sletting (rop18) med HXGPRT. Etter transfeksjon av plasmid pΔROP18 inn Δ ku80Δhxgprt og utvalg i MPA +X, MPA + X resistente kloner ble analysert for sletting av rop18. Den foreldrenes belastning kontroll er positivt for PCR 1 (~ 400 bp) og PCR 2 (~ 650 bp) produkt og negative for PCR 3 (~ 1200 bp) og PCR 4 (~ 1300 bp) produkt. En målrettet GOI knockout er positivt for de PCR2, PCR3 og PCR4 produkter og er negativ for PCR 1 produkt (se figur 2A). Vist er representative paneler av resultatene av PCR1 og PCR2 (øverste panel), PCR3 (midtre panelet), og PCR4 (nederst panel). Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 og 11 viser den korrekte inndelingsmønster av en PCR, PCR2, PCR3 og PCR4 som definerer en målrettet genet sletting hendelse i klonen. Kloner 1, 2, 7, 10 og 12 er ikke gen-slettinger, og svarer til andre mulige representative resultater. (C = foreldrekontroll belastning Δ ku80Δhxgprt, M = størrelse markører). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figur 3. Oversikt over protokollen for re-targeting genet av interesse å slette HXGPRT. A. Strategi for fjerning av HXGPRT seleksjonsmarkør av en dobbel crossover homolog rekombinasjon hendelse i belastningen Δ ku80Δgoi :: HXGPRT bruker en ~ en KBP 5 &#39;DNA-mål flanke og en ~ en KBP 3&#39; DNA-mål flanke på plasmid pΔGOIc. PCR-strategi for genotype verifisering er avbildet ved hjelp av et primerpar for å assay for en PCR-produkt (PCR5) som spenner over slettingen (ikke i målestokk). B. Et representativt primerpar konstruert for å validere fjerning av HXGPRT selekterbar markør fra gra2 locus i belastning Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primere GRA2 _CLF og GRA2_CxR forsterke PCR5. Primere<html> lese fra 5 &#39;til 3&#39;. C. Representant panel av 6TX-resistente kloner som kan oppnås følgende transfeksjon av plasmid pΔGOIc inn Δ ku80Δgoi :: HXGPRT og utvalg i 6TX. Kloner 4, 7, 9, 11 og 12 oppviser den riktige inndelingsmønster av PCR5 som tilsvarer målrettet delesjon av den HXGPRT markør (~ 1.2 kbp produkt som spenner over 3 &#39;flanke med liten overlapping med den 5&#39; flanke og utenfor tre &#39; flanke). Kloner 1, 2, 3, 6, 8 og 10 (dette båndet er lys) representerer forventet inndelingsmønster på ca ~ 3.4 kbp som svarer til den parentale klone genotype, selv om disse kloner oppviste en grad av motstand mot 6TX som tillot deres valg (denne fenotypen tidvis kan oppstå spontant ved nedstenging av HXGPRT uttrykk (se merknad i protokollen 2.1 (trinn 8) og representant Resultater avsnitt). (C = foreldrekontroll belastning Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = størrelse markører).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klikk her for å se større figur. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figur 4. Utforming av en målsøkende DNA-molekyl for å kode den C-terminale ende av et protein. Strategien er basert på evnen av den HXGPRT markør til også virke som et 3 &#39;nedstrøms regulatoriske område. Ryggraden i pΔGOItag er pRS416 shuttle vektor som inneholder uracil (URA) og ampicillin (AMP) valgbare markører. Satt inn pRS416 er en ~ en KBP 5 &#39;DNA-mål flanke forsterket fra genomisk DNA med overlapper for HXGPRT minigene kassett og pRS416 bruker Fgoi og Rtag primere, en ~ en KBP 3&#39; DNA-mål flanke er forsterket fra genomisk DNA med omlegg for den HXGPRT minigene kassett og pRS416 bruke F2 og R2primere og HXGPRT minigene kassett. 5 &#39;DNA-mål flanke erstatter oppsigelse kodonet med merkelappen (HA, Myc, Hans, etc.), etterfulgt av en ny oppsigelse kodon. MPA + X utvalg integrerer den C-terminale-kode og en nedstrøms HXGPRT, og beveger den 3 &#39;UTR til en stilling som følge av den HXGPRT markør. Følgende unike restriksjonsenzymseter fordøye nettsteder er lagt til primere: RE.X (begrensning enzym X cut stedet) i Fgoi primer å kutte plasmidet på 5 &#39;enden av fem&#39; DNA-mål flanke, og RE.Y i R2 primer å kutte plasmidet på 3 &#39;enden av 3&#39; DNA-mål flanke, og RE.Z i Rtag og F2 primere til avgiftsdirektoratet HXGPRT minigene kassett til bruk for plasmid konstruksjon for å re-målrette merket genet locus å slette den HXGPRT markør som vil gjenopprette plasseringen av 3 &#39;UTR.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation in ÃŽâ€ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii at JoVE.com

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Her rapporterer vi en metode for å bruke type I og type II<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer av<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Å effektivt generere målrettede genet slettinger og genet erstatninger for funksjonell genomisk analyse.

Genetisk manipulering i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer for Funksjonell genom analyse av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En Screeningsteknikken å isolere Toxoplasma gondii Host-celle Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetiske tilnærminger i<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Etter i Real Time Impact of Pneumokokk virulens faktorer i en akutt Mouse Lungebetennelse Modell Bruke Bioluminescent Bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging av myeloide celler Dynamics i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Tarmsvulster ved å spinne Disk Konfokalmikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics vinduene ved hjelp Makrofager å identifisere<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Viktig for Resistance til IFN-γ-Dependent Cell Autonomous immunitet

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...