Este trabalho foi financiado por concessões do NIH para DJB (AI041930, AI073142, AI075931 e AI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós fornecemos um protocolo eficiente para o gene alvo em Δ Ku80 linhagens do parasita para permitir a recuperação eficiente de descendentes geneticamente manipulados que possuem deleções de genes-alvo, substituição de genes e / ou genes marcados. A execução sequencial destes métodos proporciona uma abordagem fiável para o isolamento de mutantes que contêm parasitas manipulações genéticas específicas únicas ou múltiplas 1-3. Embora a geração de uma deleção alvo depende de múltiplos factores, a utilização da estirpe Δ Ku80 com a estratégia apresentada protocolo e aumenta grandemente a facilidade e eficiência de fazer precisamente definidos estirpes mutantes de T. gondii para estudos de genômica funcional. O genoma de T. gondii durante as fases assexuadas é haplóide. Assim, uma consideração a fazer quando se pretende eliminar um gene é o gene que não deve ser essencial in vitro. No entanto, a eficiência da tarjating nocautes genéticas em linhagens Ku80 Δ é extremamente alta, e isso permite o isolamento de cepas mutantes com taxas de replicação prejudicada significativamente. Se o alvo é um gene essencial, parasitas muitas vezes deixam de se replicar no decurso da selecção. Outro factor crítico na manipulação genética alvo é que perfeita homologia com pelo menos 620 pb do flanco genómico alvo é necessária para obter detectáveis ​​integrações orientadas 2. Regiões mais longos de homologia produzir maiores eficiências de segmentação e segmentação usando os flancos de DNA de aproximadamente 1.000 bp é um método confiável e eficiente 1-4. Por esta razão, é importante que genómicas flancos de direccionamento são gerados a partir da mesma estirpe de T. gondii (RH, Pru) como a estirpe que está a ser geneticamente manipulados. Falta de homologia suficiente pode freqüentemente resultar na integração alvo de um flanco alvo genômico, mas não o outro. Integração incompleta ou falha para obter uma ma nocautey também ser devido à persistência episomal. Imediatamente após a transfecção, todas as moléculas de direccionamento são epissomas não integrado, e moléculas de direccionamento, por vezes pode persistir como epissomas, por muitas gerações. Usando flancos DNA alvo de ~ 1 Kbp e continuar a passar os parasitas sob seleção antes de re-subcloning freqüentemente resolve problemas associados com a persistência episomal. Uma vez que um nocaute é validada e o marcador HXGPRT é removido, a estratégia do gene alvo pode ser repetido com uma segunda GI para gerar deleções de genes múltiplos numa única estirpe de parasita 1-3. A geração de deleções, substituições, ou genes etiquetados pode também ser conseguida por meio de diferentes marcadores seleccionáveis ​​(bleomicina, CAT, DHFR resistente a pirimetamina, etc.) Embora o marcador de selecção CAT actualmente está presente no tipo II Δ Ku80 Pru um genoma, este marcador pode ser removido usando a HXGPRT </em&gt; protocolo de selecção descrito aqui. Em nossas mãos, a seleção HXGPRT é o mais seguro eo marcador mais eficiente, com a maior eficiência visando onde uma única cópia de inserção alvo é suficiente para a seleção robusta em MPA + X médio. HXGPRT também fornece a única abordagem atualmente útil para eliminação sistemática de um marcador seleccionável (Figura 3) utilizando 6-tioxantina (6TX) selecção 2,3. Assim, este protocolo constitui a única abordagem atual para o desenvolvimento de cepas mutantes definidos com diversas manipulações genéticas específicas. Este protocolo proporciona um método valioso e eficiente para a manipulação genética alvo em Δ Ku80 estirpes de T. gondii e é aplicável à análise de um único gene, uma família de genes, ou em estudos genómicos funcionais do genoma completo. Antes da disponibilidade de Δ Ku80 estirpes 1,2, estas abordagens não foram amplamente viável devido à inefficiency destes métodos. Consequentemente, este protocolo é amplamente aplicável para a manipulação genética específica de Toxoplasma gondii e é acessível a todos os investigadores interessados ​​em abordar uma série de questões sobre biologia parasitária, a resposta do hospedeiro e genômica funcional.

Toxoplasma gondii é um parasita obrigatório comum protozoário intracelular que freqüência e cronicamente infecta uma grande variedade de animais e seres humanos 5. Estima-se que mais de 1 bilhão de seres humanos são atualmente e cronicamente infectadas pelo patógeno. Em adição à importância da doença causada por T. infecção gondii, a crescente disponibilidade de ferramentas experimentais, poderosos recursos da genômica 6, facilidade de cultivo in vitro e excelentes modelos de ratos fizeram T. gondii um sistema modelo de liderança para o estudo mais amplo de patógenos eucarióticos intracelulares e outros parasitas apicomplexan significativos que causam doenças devastadoras como a malária (Plasmodium sp.) ea criptosporidiose (Cryptosporidium) 5,7. Uma limitação significativa de Toxoplasma gondii como um organismo modelo tem sido a recuperação ineficiente de progênie que transportam alvo de manipulações genéticas. Este problem na segmentação gene é devido a uma baixa frequência de recombinação homóloga em relação à freqüência muito alta de nonhomologous recombinação em cepas do tipo selvagem de T. gondii, mesmo quando uma extensa homologia de ADN é fornecida em moléculas alvo de ADN utilizados em estudos genéticos 2. Recentemente geneticamente bloquearam a principal via de nonhomologous recombinação em tipo I e tipo II cepas de Toxoplasma gondii, excluindo o gene que codifica a proteína 1,2 Ku80. O tipo I, resultante e Ku80 Δ estirpes de tipo II exibem taxas de crescimento normais, de tamanho e de comportamento tanto in vitro e in vivo e durante taquizoíto fases bradyzoite in vitro e in vivo, no entanto, estas estirpes exibem essencialmente uma frequência de 100% de recombinação homóloga e esta fenótipo aumenta a probabilidade de isolar rapidamente progênie desejada de manipulações genéticas específicas por várias centenas a vários thoUSand vezes 1,2,4. De toda a comunidade uso recente de tipo I e tipo II cepas Δ Ku80 tem significativamente incrementada o ritmo, a variedade, assim como a taxa de abordagens genéticas específicas em T. sucesso gondii 1-4,8-13. Aqui nós descrevemos um protocolo abrangente para eliminação gene alvo, substituição de gene, e marcação gene em Δ Ku80 cepas de T. gondii. Demonstramos como projetar e direcionar de forma confiável as manipulações genéticas de genes específicos ou loci genéticos em Δ Ku80 cepas de Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Targeted manipulação genética utilizando a recombinação homóloga é o método de escolha para a análise genómica funcional para se obter uma visão detalhada da função do gene e do fenótipo da (s). O desenvolvimento de estirpes mutantes com deleção do gene-alvo, as mutações de função do gene alvo, complementado, e / ou genes etiquetados fornece poderosas estratégias para lidar com a função do gene, especialmente se estas manipulações genéticas podem ser eficientemente orientadas para o locus do gene de interesse utilizando integração mediada por duplo atravessar a recombinação homóloga. Devido às elevadas taxas de recombinação não homóloga, a análise funcional do genoma de T. gondii foi previamente limitada pela ausência de métodos eficientes para a segmentação deleções de genes e as substituições de genes de loci genéticos específicos. Recentemente, foi abolida a principal via de nonhomologous recombinação em tipo I e tipo II cepas de T. gondii, excluindo o gene encodin1,2 g de proteína a Ku80. As estirpes Δku80 comportar-se normalmente durante taquizoíto (aguda) e bradyzoite (crónica) Ciclo in vitro e in vivo e exibem essencialmente uma frequência de 100% de recombinação homóloga. As estirpes Δ Ku80 fazer estudos genómicos funcionais viável no único gene, bem como da escala do genoma 1-4. Aqui, apresentamos métodos para usar tipo I e tipo II cepas Δku80Δhxgprt para avançar abordagens de segmentação de genes em T. gondii. Nós delinear métodos eficientes para a geração de deleções, substituições de genes, e os genes marcados pela inserção alvo ou exclusão do phosphoribosyltransferase marcador selecionável hipoxantina-xantina-guanina (HXGPRT). O gene alvo protocolo descrito pode ser utilizado numa variedade de maneiras em Δku80 estirpes para avançar a análise funcional do genoma do parasita e para desenvolver estirpes individuais que carregammúltiplo alvo manipulações genéticas. A aplicação deste método de genética e fenotípica subseqüentes irá revelar aspectos fundamentais e únicos da biologia de T. gondii e relacionados com patógenos humanos significativos que causam a malária (Plasmodium sp.) ea criptosporidiose (Cryptosporidium).

Um molde detalhada é fornecida para a construção de um plasmídeo de direccionamento para eliminar um gene, incluindo a colocação de locais de enzimas de restrição e geração dos iniciadores que facilitam a segmentação genética e validação do gene alvo, bem como a construção do plasmídeo para a eliminação subsequente do HXGPRT numa processo de uma só etapa (Figuras 1A-C, Figura 2A, Figura 3A). Um esquema geral é apresentado para fazer uma deleção do gene alvo (Figura 2A), os pares de iniciadores utilizados para validar a supressão de um nocaute, por exemplo, tipo I ROP18 (Figura 2B), e os resultados representativos da validação de PCR estão mostrados (Figura 2C). Este resultado representativo é mostrado para ilustrar a gama de resultados que podem ser obtidos nos loci genéticos que são relativamente difíceis de atingir. A deleção do gene alvo com sucesso irão resultar na ausência do gene emteresse produto de PCR (PCR 1), a presença da extremidade 3 &#39;do genoma alvo flanco (pCR2), e a presença do marcador seleccionável HXGPRT adequadamente integradas entre as extremidades 5&#39; e genómicas flancos segmentação 3 &#39;que definem a deleção (PCR3 e protocolo PCR4) . Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 e 11 são validados deleções de genes alvo (nocautes), onde HXGPRT substituiu o GOI (Figura 2C). Um clone que não contém uma deleção do gene pode ser representado por uma variedade de padrões de bandas. Tipicamente, um clone sem uma deleção do gene irá espelhar a estirpe parental (padrão dos pais) com bandas observadas por PCR1 e pCR2, mas não para PCR3 ou protocolo PCR4 como visto para os clones 1 e 2 (Figura 2C). Este &quot;padrão parental&quot; surge a partir de alguns mecanismos potenciais. Ocasionalmente, parasitas resistentes selecionados MPA realizar não integrados episomas persistentes do pΔGOI segmentação plasmídeo, e notamos que a seleção continuada muitas vezes obriga esses episomasintegrar. Observamos, também, algum fundo rara do tipo I Δ estirpe Ku80 devido a integração não intencional do pΔGOI plasmídeo de direccionamento, que contém um cDNA HXGPRT expressa através de DHFR 5 &#39;e 3&#39; elementos promotores, em qualquer locus DHFR ou para a HXGPRT parcialmente suprimida lócus 14. Embora este evento raro é uma integração alvo, não foi a integração pretendida e serve como um ponto chave para se lembrar na criação de qualquer estratégia de substituição de genes. Homologia DNA superior a 120 bp realizadas em seu pΔGOI alvo plasmídeo pode fornecer um local alternativo para a recombinação em Δ cepas Ku80 dois que poderiam dar para trás um fundo indesejado. Na Segunda Pru Δ estirpe do tipo Ku80 este fundo é reduzido ou inexistente comparativamente ao tipo I porque o marcador seleccionável HXGPRT é baseada no tipo I que possuem sequências nucleotídicas polimorfismos quando comparados com o ADN do tipo II quereduz significativamente este cenário raro em experimentos usando o tipo II Pru Δ Ku80 tensão 1. Se um locus genético é essencial (não pode ser excluído), ou tem um gene extremamente baixa alvo de freqüência no local, ou se persiste [não integrado] episomas não são facilmente eliminados através do crescimento e seleção, este padrão parental vai dominar o padrão observado em MPA os clones resistentes. Alternativamente, a molécula de ADN de direccionamento é por vezes observado para integrar a apenas a extremidade 5 &#39;ou 3&#39; do genoma alvo flanco e de uma banda é observada tanto para PCR3 ou protocolo PCR4 (mas não ambos), juntamente com PCR1 pCR2 e como pode ser visto para o clone 10 (5 &quot;integração) e clone 7 (3 &#39;integração) (Figura 2C). Estes padrões sugerem a ocorrência frequente de um único cruzamento sobre a integração do plasmídeo de direccionamento no locus que integra HXGPRT mas essa integração alvo não exclui o gene de interesse. Este padrão (faixas 7 e 10 na Figura 2C) EMphasizes a necessidade de comunicar dados de PCR para verificar a integração alvo que ocorreu em vez de um único atravessar homólogo e mais de um segundo integração não homóloga da molécula de alvejamento. Raramente, observamos uma mistura genética representada pelo clone 12 (Figura 2C), que representa tanto um padrão parental e um padrão de eliminação sistemática. Este padrão mais provável surge na ocasião a partir de dois genótipos de parasitas que se encontram presentes no mesmo local, em um clonagem bem. Um esquema geral para a remoção de HXGPRT de Δ ku80Δgoi :: HXGPRT excluir HXGPRT na estirpe é mostrado (Figura 3A). O par de primers utilizados para validar a remoção de HXGPRT de Δ Δ Ku80 gra2 :: HXGPRT (Figura 3B) amplifica a ~ 1,2 Kbp banda única no PCR5 como visto em clones 4, 7, 9, 11 e 12 (Figura 3C). Se HXGPRT não é removida do local, a ~ 3.4 Kbp banda é observada (clones 1, 2, 3, 6, 8, 10, eo controle parental). Vários mecanismos actuar para fazer a remoção do HXGPRT (6TX selecção) mais difícil e menos eficiente do que a integração de HXGPRT (MPA + X selecção). Selecção de MPA é simplesmente mais eficiente do que 6TX selecção 14,16. Além disso, são necessários níveis mais elevados de expressão de selecção HXGPRT 6TX que para selecções MPA 16,24. Consequentemente, as mutações que podem reduzir a atividade enzimática HXGPRT ou mutações ou alterações epigenéticas que reduzem o nível de HXGPRT expressão em lugar de um gene pode, potencialmente, eliminar a eficácia da seleção 6TX. Mesmo com estes desafios de selecção 6TX, a taxa de selecção em estirpes 6TX Δ Ku80 sucesso é superior a 90% na primeira tentativa 1-3. Um esquema geral para a direta marcação C-terminal de genes codificadores de proteínas é mostrado (Figura 4). Esteesquema usa a integração directa através cruz dupla recombinação homóloga ao longo de HXGPRT 3 &#39;do gene marcado e também emprega estratégias de validação semelhantes aos descritos acima. Quando se suspeita que um gene seja um gene essencial este pode ser verificado através de uma segunda transfecção com um alvo de DNA de plasmídeo isolado de forma independente. Métodos alternativos, tais como esquemas de expressão gênica regulada, estão disponíveis para posterior verificação se um gene é essencial 25. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figura 1. Resumo do desenho de um ADN plasmídeo de direccionamento. A. Esquemática para a concepção de sobreposição primers utilizados para PCR amplificar a 5 &#39;e 3&#39; flancos alvo com 33 sobrepõe pb para o transporte vetor e cassete minigene HXGPRT pRS416. Os iniciadores descritos no esquema foramusado para gerar a extremidade 5 &#39;e 3&#39; flancos alvo de pΔROP18 10. B. Estratégia geral para a concepção de uma molécula de ADN alvo. A espinha dorsal da pΔGOI é o pRS416 shuttle vector contendo uracila (URA) e ampicilina (AMP) marcadores selecionáveis. Inserido em pRS416 é um ~ 1 Kbp 5 &#39;do ADN flanco alvo amplificado a partir de ADN genómico com sobreposições para a cassete de minigene HXGPRT pRS416 e utilizando os iniciadores F1 e R1, um ~ 1 kpb 3&#39; do ADN flanco alvo é amplificado a partir de ADN genómico com sobreposições para a cassete de minigene HXGPRT e pRS416 utilizando os primers de F2 e R2 e da cassete de minigene HXGPRT. Os seguintes locais de digest de enzimas de restrição únicos são adicionados aos iniciadores: RE.X (local de corte da enzima de restrição X), no iniciador F1 para cortar o plasmídeo na extremidade 5 &#39;da região 5&#39; do DNA alvo flanco, RE.Y no R2 iniciador para cortar o plasmídeo no &#39;final da extremidade 3&#39; do ADN de 3 flanco RE.Z alvo e os iniciadores em R1 e F2 para excisar a HXGPRT minC. seqüências Primer cassete igene. usados ​​para gerar a construção visando a supressão de ROP18. As regiões em negrito correspondem a T. gondii sequência genómica e as regiões nonbold correspondem aos locais de enzimas de restrição e as sequências que se sobrepõem com a cassete e pRS416 minigene HXGPRT. O HX_F e HX_R par de primers amplifica a cassete minigene HXGPRT 14. Os iniciadores ler de 5 &#39;para 3&#39;. Tabela adaptada de Fentress et al 10. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figura 2. Visão geral do protocolo para a supressão de um gene usando HXGPRT. A. Disruption de um GOI na estirpe ku80Δhxgprt Δ por um duplo evento de recombinação homóloga cruzado utilizando um ~ 1 Kbp 5 &#39;do DNA-alvo e um flanco ~ 1 kpb 3&#39; do ADN alvo no flanco pΔGOI plasmídeo. A estratégia de PCR utilizando PCR1, pCR2, PCR3 e protocolo PCR4 (não à escala) é mostrado que possibilite a verificação genótipo para validar clones específicas de integração de HXGPRT e exclusão do locus GOI. B. pares de primers Representante projetado para validar a supressão da ROP18 . ROP18_DF e ROP18_DR amplificar PCR1, ROP18_ExF e ROP18_CxR amplificar pCR2, ROP18_CxF e DHFR_CxR amplificar PCR3 e DHFR_CxF e ROP18_CxR amplificar protocolo PCR4 (ver Figura 2A). Os iniciadores ler de 5 &#39;para 3&#39;. Tabela adaptada de Fentress et al 10. C. Os resultados representativos de validação de uma deleção do gene alvo (ROP18) usando HXGPRT. Após transfecção de plasmídeo pΔROP18 em Δ ku80Δhxgprt e seleção em MPA +X, MPA + X clones resistentes foram analisadas para a exclusão de ROP18. Cepa parental O controle é positivo para PCR 1 (~ 400 pb) e PCR 2 (~ 650 pb) do produto e negativo para a PCR 3 (~ 1200 pb) e PCR 4 (~ 1300 pb) do produto. Um nocaute GI alvo é positivo para os produtos pCR2, PCR3 e protocolo PCR4 e é negativo para o produto 1 da PCR (ver Figura 2A). São mostrados painéis representativos dos resultados da PCR1 e pCR2 (painel superior), PCR3 (painel do meio) e protocolo PCR4 (painel inferior). Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 e 11 apresentam o padrão de bandas correto de PCR 1, pCR2, PCR3 e protocolo PCR4 que define um evento de deleção do gene alvo no clone. Clones 1, 2, 7, 10 e 12 não são deleções de genes, e correspondem a outros potenciais resultados representativos. (C = tensão de controlo parental Δ ku80Δhxgprt, M = marcadores de tamanho). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figura 3. Visão geral do protocolo para a re-segmentação do gene de interesse para excluir HXGPRT. A. Estratégia para a remoção do marcador de selecção HXGPRT por um duplo evento de recombinação homóloga passagem na estirpe Δ ku80Δgoi :: HXGPRT utilizando um ~ 1 Kbp 5 &#39;do DNA-alvo e um flanco ~ 1 kpb 3&#39; do ADN alvo no flanco pΔGOIc plasmídeo. A estratégia de PCR para verificação genótipo é descrita usando um par de iniciadores de ensaio para um produto de PCR (PCR5) que se estende a deleção (sem escala). B. Um par de primers representativa destinada a validar a remoção do marcador seleccionável HXGPRT do gra2 lócus de tensão Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF e GRA2_CxR amplificar PCR5. Primers<html> ler a partir de 5 &#39;para 3&#39; do painel. C. Representante da 6TX clones resistentes que podem ser obtidos seguinte pΔGOIc transfecção de plasmídeo em Δ ku80Δgoi :: HXGPRT e seleção em 6TX. Os clones 4, 7, 9, 11 e 12 apresentam o padrão de bandas do PCR5 correcta que corresponde à deleção alvo do marcador HXGPRT (~ 1,2 Kbp do produto que se estende »flanco com ligeira sobreposição com a extremidade 5 &#39;do flanco 3 e fora da 3&#39; flanco). Os clones 1, 2, 3, 6, 8, e 10 (esta banda é leve) representam o padrão de bandas previsto de cerca de ~ 3,4 kpb, que corresponde ao clone de genótipo parental, embora estes clones exibiram um grau de resistência ao 6TX que permitiram sua seleção (este fenótipo, ocasionalmente, pode surgir espontaneamente por desligamento de expressão HXGPRT (ver nota no protocolo 2.1 (etapa 8) e seção Resultados Representante). (C = tensão de controlo parental Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = marcadores de tamanho).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver a figura maior. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figura 4. Desenho de uma molécula de ADN alvo para marcar a extremidade C-terminal de uma proteína. A estratégia baseia-se na capacidade do marcador HXGPRT para também funcionar como um iniciador 3 &#39;a região reguladora a jusante. A espinha dorsal da pΔGOItag é o pRS416 transporte vetor contendo uracila (URA) e ampicilina (AMP) marcadores selecionáveis. Inserido em pRS416 é um ~ 1 Kbp 5 &#39;do ADN flanco alvo amplificado a partir de ADN genómico com sobreposições para a cassete de minigene HXGPRT e pRS416 usando o Fgoi e rtag iniciadores, um ~ 1 kpb 3&#39; do ADN flanco alvo é amplificado a partir de ADN genómico com sobreposições para a cassete de minigene HXGPRT e pRS416 usando o F2 e R2primers ea cassete minigene HXGPRT. A 5 &#39;do ADN alvo flanco substitui o codão de terminação com a marca (HA, Myc, His, etc), seguida por um codão de terminação da substituição. MPA + X selecção integra a etiqueta C-terminal e um HXGPRT jusante, e move a UTR 3 &#39;para uma posição na sequência do marcador HXGPRT. Os seguintes locais de digest de enzimas de restrição únicos são adicionados aos iniciadores: RE.X (local de corte da enzima de restrição X), no iniciador Fgoi para cortar o plasmídeo na extremidade 5 &#39;da região 5&#39; do DNA alvo flanco e no RE.Y R2 primer para cortar o plasmídeo no &#39;final da extremidade 3&#39; do flanco 3 ADN alvo, e RE.Z no rtag iniciadores e F2 para excisar o minigene HXGPRT cassete para uso na construção de plasmídeo de re-orientar o locus do gene marcado para eliminar o marcador HXGPRT que irá restaurar o posicionamento da UTR 3 &#39;.

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Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Aqui nós relatamos um método para usar tipo I e tipo II<em&gt; Δku80</em&gt; Estirpes<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Para gerar de forma eficiente deleções de genes-alvo e substituições de genes para análise genômica funcional.

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

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