Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH a DJB (AI041930, AI073142, AI075931 y AI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí se proporciona un protocolo para génica eficaz focalización en Δ Ku80 cepas de parásitos para permitir la recuperación eficiente de la progenie manipulado genéticamente que poseen deleciones de genes específicos, reemplazos de genes, y / o genes etiquetados. La ejecución secuencial de estos métodos proporciona un enfoque fiable para el aislamiento de mutantes de parásitos que contienen manipulaciones genéticas específicas únicas o múltiples 1-3. Mientras que la generación de una deleción específica depende de múltiples factores, el uso de la cepa Δ Ku80 con la estrategia y el protocolo presentado aumenta en gran medida la eficiencia y la facilidad de hacer cepas mutantes definidos con precisión de T. gondii para estudios de genómica funcional. El genoma de T. gondii durante las etapas asexuales se haploides. Por lo tanto para hacer una consideración en la planificación para eliminar un gen es el gen que no debe ser esencial in vitro. Sin embargo, la eficiencia de targeting genes knockouts en Δ KU80 cepas es muy alta, lo que permite el aislamiento de cepas mutantes con tasas de repetición discapacidad significativa. Si un gen objetivo es esencial, los parásitos a menudo dejan de repetir durante la selección. Otro factor crítico en la manipulación genética específica es que la homología perfecta con al menos 620 pares de bases del flanco focalización genómico se requiere para obtener integraciones dirigidas detectables 2. Regiones más largas de homología producen una mayor eficiencia de la focalización y el uso dirigido bandas de ADN de aproximadamente 1000 pares de bases es un método fiable y eficiente 1-4. Por esta razón es importante que los flancos dirigidos genómicas se generan a partir de la misma cepa de T. gondii (RH, Pru) como la cepa que está siendo manipulado genéticamente. La falta de suficiente homología puede dar como resultado con frecuencia en la integración dirigida de un flanco orientación genómica, pero no el otro. Integración incompleta o no obtención de un ma knockouty también ser debido a la persistencia episomal. Inmediatamente después de la transfección, todas las moléculas de direccionamiento están NONINTEGRATED episomas, y, a veces moléculas de direccionamiento pueden persistir como episomas para muchas generaciones. Usando objetivo flancos de ADN de ~ 1 Kbp y continuando a pasar parásitos bajo la selección antes de volver a subclonación con frecuencia resuelve los problemas asociados con la persistencia episomal. Una vez que un golpe de gracia se valida y se elimina el marcador HXGPRT, la estrategia de selección de genes se puede repetir en una segunda GOI para generar supresiones de genes múltiples en una sola cepa del parásito 1-3. La generación de deleciones, sustituciones, o genes etiquetados también se puede lograr mediante el uso de diferentes marcadores de selección (bleomicina, CAT, pirimetamina resistente DHFR, etc). Aunque el marcador seleccionable CAT Actualmente está presente en el tipo II Δ Ku80 Pru genoma 1, este marcador se puede eliminar mediante el HXGPRT </em&gt; protocolo de selección descritos aquí. También En nuestras manos, la selección HXGPRT es el más seguro y el marcador más eficiente con la más alta eficiencia selección del objetivo, una única copia de inserción dirigida es suficiente para la selección robusta en AMP + X medio. HXGPRT proporciona actualmente el único enfoque útil para deleción dirigida de un marcador de selección (Figura 3) usando 6-tioxantina (6TX) selección 2,3. Así, este protocolo ofrece el único enfoque actual para el desarrollo de cepas mutantes definidos con varias manipulaciones genéticas específicas. Este protocolo proporciona un método valioso y eficiente para la manipulación genética específica en Ku80 Δ cepas de Toxoplasma gondii y es aplicable al análisis de un solo gen, una familia de genes, o estudios de genómica funcional en todo el genoma. Antes de la disponibilidad de las cepas Ku80 Δ 1,2, estos enfoques no eran ampliamente factible debido a la ineFficiency de estos métodos. Por lo tanto, este protocolo es ampliamente aplicable para la manipulación genética dirigida de Toxoplasma gondii y es accesible a todos los investigadores interesados ​​en el tratamiento de una serie de preguntas sobre la biología del parásito, respuesta del huésped, y la genómica funcional.

Toxoplasma gondii es un protozoo parásito intracelular obligado común que infecta de manera crónica con frecuencia y una amplia gama de los animales y los seres humanos 5. Se estima que más de 1 billón de seres humanos son actualmente y crónicamente infectado por este patógeno. Además de la importancia de la enfermedad causada por T. infección gondii, la creciente disponibilidad de herramientas experimentales, potentes recursos genómica 6, la facilidad de crecimiento in vitro y excelentes modelos de ratón han hecho T. gondii un modelo de sistema principal para el estudio más amplio de los eucariotas patógenos intracelulares y otros parásitos apicomplexan importantes que causan enfermedades devastadoras como la malaria (Plasmodium sp.) y criptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7. Una limitación significativa de Toxoplasma gondii como un organismo modelo ha sido la recuperación ineficaz de la progenie que transportan dirigido manipulaciones genéticas. Este problem en la orientación de genes se debe a una baja frecuencia de recombinación homóloga con respecto a la alta frecuencia de recombinación no homóloga de cepas salvajes de T. gondii incluso cuando extensa homología de ADN se proporciona en moléculas diana de ADN utilizados en los estudios genéticos 2. Recientemente hemos genéticamente bloqueado la principal vía de recombinación no homóloga en cepas de tipo I y de tipo II Toxoplasma gondii mediante la supresión del gen que codifica la proteína de 1,2 KU80. El tipo I resultante y Δ Ku80 cepas de tipo II exhiben tasas de crecimiento normales, el tamaño y el comportamiento tanto in vitro como in vivo, durante las etapas de taquizoitos y bradyzoite in vitro e in vivo, sin embargo, estas cepas presentan esencialmente una frecuencia de 100% de la recombinación homóloga y esto fenotipo aumenta la probabilidad de aislar rápidamente la progenie deseada de manipulaciones genéticas específicas por varios cientos a varios Thousand veces 1,2,4. Recientes de toda la comunidad el uso de cepas de tipo I y tipo II Δ KU80 ha incrementado significativamente el ritmo, la variedad, así como la tasa de éxito de los enfoques genéticos específicos en T. gondii 1-4,8-13. Aquí se describe un protocolo general para la eliminación dirigida de genes, la sustitución de genes, y el etiquetado de genes en Δ KU80 cepas de T. gondii. Demostramos cómo diseñar y orientar fiable manipulaciones genéticas de genes específicos o loci genéticos en Δ KU80 cepas de Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Manipulación genética dirigida usando recombinación homóloga es el método de elección para el análisis genómico funcional para obtener una vista detallada de la función del gen y el fenotipo (s). El desarrollo de cepas mutantes con deleciones específicas de genes, mutaciones dirigidas, la función de gen, complementados y / o genes etiquetados proporciona estrategias de gran alcance para hacer frente a la función del gen, en particular si estas manipulaciones genéticas pueden ser dirigidos de manera eficiente al locus del gen de interés utilizando la integración mediada por doble cruzar la recombinación homóloga. Debido a la muy alta tasa de recombinación homóloga, el análisis genómico funcional de Toxoplasma gondii se ha limitado anteriormente por la falta de métodos eficaces para la orientación supresiones de genes y sustituciones de genes de loci genéticos específicos. Recientemente, hemos abolido la principal vía de recombinación homóloga en el tipo I y las cepas de T. tipo II gondii mediante la supresión del gen encodin1,2 g de la proteína KU80. Los Δku80 cepas se comportan normalmente durante bradyzoite etapas (crónica) in vitro e in vivo de taquizoitos (aguda) y y exhiben esencialmente una frecuencia de 100% de la recombinación homóloga. Las cepas Δ Ku80 hacen estudios de genómica funcional factible en el gen individual, así como en la escala de genoma 1-4. Aquí, se presenta métodos para el uso de cepas de tipo I y tipo II Δku80Δhxgprt para avanzar genes enfoques de orientación en T. gondii. Nosotros describimos métodos eficientes para producir supresiones de genes, reemplazo de genes, y los genes etiquetados por inserción o deleción dirigida de la fosforribosiltransferasa marcador seleccionable hipoxantina-xantina-guanina (HXGPRT). El gen descrito focalización protocolo se puede utilizar en una variedad de maneras en Δku80 cepas para avanzar en el análisis funcional del genoma del parásito y para desarrollar cepas individuales que llevanmúltiple dirigido manipulaciones genéticas. La aplicación de este método genético y ensayos fenotípicos posteriores revelará aspectos fundamentales y únicos de la biología de T. gondii y los patógenos humanos importantes relacionados que causan la malaria (Plasmodium sp.) y criptosporidiosis (Cryptosporidium).

Una plantilla detallada se proporciona para la construcción de un plásmido dirigido a eliminar un gen, incluyendo la colocación de sitios de enzimas de restricción y la generación de los cebadores que facilitan la modificación genética dirigida y validación de genes de la orientación, así como la construcción de plásmidos para la posterior eliminación de HXGPRT en un proceso de un solo paso (Figuras 1A-C, Figura 2A, Figura 3A). Un esquemático general que se presenta para la fabricación de una deleción dirigida de genes (Figura 2A), los pares de cebadores utilizados para validar la eliminación de un golpe de gracia, por ejemplo, de tipo I rop18 (Figura 2B), y los resultados representativos de la validación de PCR se muestran (Figura 2C). Este resultado representativo se muestra para ilustrar la gama de resultados que se pueden obtener en los loci genéticos que son relativamente difíciles de destino. Una deleción del gen dirigido con éxito dará lugar a la ausencia del gen de enterés producto de PCR (PCR 1), la presencia de la 3 &#39;flanco focalización genómico (PCR2), y la presencia del marcador seleccionable HXGPRT correctamente integrado entre el 5&#39; y los flancos dirigidos genómicas 3 &#39;que definen la supresión (PCR3 y PCR4) . Los clones 3, 4, 5, 6, 8, 9, y 11 se validan las supresiones de genes específicos (knockouts) donde HXGPRT ha sustituido el GOI (Figura 2C). Un clon que no contiene una deleción del gen puede ser representado por una variedad de patrones de bandas. Típicamente, un clon sin una deleción del gen será un reflejo de la cepa parental (patrón de los padres) con bandas observadas para la PCR1 y PCR2, pero no para PCR3 o PCR4 como se ha visto para los clones 1 y 2 (Figura 2C). Este &quot;patrón parental&quot; surge de algunos mecanismos potenciales. En ocasiones, las AMP parásitos resistentes seleccionados llevan no integradas episomas persistentes del pΔGOI dirigidos plásmido, y nos cuenta que la selección continua a menudo obliga a los episomaspara integrar. También observamos algunos antecedentes rara en el tipo I Δ cepa Ku80 debido a la integración no intencionado de la pΔGOI focalización plásmido, que contiene un ADNc HXGPRT expresado a través de la DHFR 5 &#39;y 3&#39; los elementos del promotor, ya sea en el locus de DHFR o en el HXGPRT parcialmente suprimido locus de 14. Si bien este raro evento es una integración dirigida, que no era la integración previsto y sirve como un punto clave para recordar en el diseño de cualquier estrategia de sustitución de genes. Homología de ADN mayor de 120 pb realizadas en su pΔGOI orientación plásmido puede proporcionar un sitio alternativo para la recombinación de cepas Δ KU80 2 que pueden dar vuelta un fondo no deseado. En la cepa del tipo II Pru Δ Ku80 este fondo se reduce o inexistente en comparación con el de tipo I debido a que el marcador seleccionable HXGPRT se basa en secuencias de tipo I que tienen polimorfismos de nucleótido en comparación con el ADN de tipo II que sereduce en gran medida esta rara experiencia en experimentos con el tipo II Pru Δ Ku80 tensión 1. Si un locus del gen es esencial (no puede borrarse), o tiene un muy bajo la orientación de genes frecuencia en el locus, o si persiste [NONINTEGRATED] episomas no se eliminan fácilmente por el crecimiento y la selección, este patrón parental dominará el patrón observado en MPA clones resistentes. Alternativamente, la molécula de ADN diana se observa a veces para integrar en sólo el 5 &#39;o 3&#39; genómica flanco focalización y una banda que se observa para ya sea PCR3 o PCR4 (pero no ambos) junto con PCR1 y PCR2 como se ve para el clon 10 (5 &quot;integración) y el clon 7 (3 &#39;integración) (Figura 2C). Estos patrones sugieren la ocurrencia poco frecuente de una sola cruz sobre la integración del plásmido en el locus focalización que integra HXGPRT pero esta integración dirigida, no se elimina el gen de interés. Este patrón (líneas 7 y 10 en la Figura 2C) emphasizes la necesidad de reportar los datos de PCR para verificar la integración dirigida que se produjo en lugar de una sola cruz homóloga más de un segundo y la integración no homóloga de la molécula de direccionamiento. En raras ocasiones, se observa una mezcla genética representada por el clon 12 (Figura 2C) que representa a la vez un patrón de los padres y un patrón de deleción dirigida. Este patrón más probable es que en ocasiones surge a partir de dos genotipos de parásitos que están presentes en el mismo lugar en una de clonación bien. Se muestra un esquema general para la eliminación de HXGPRT de Δ ku80Δgoi :: HXGPRT para eliminar HXGPRT de la cepa (Figura 3A). El par de cebadores utilizado para validar la eliminación de HXGPRT de Ku80 Δ Δ gra2 :: HXGPRT (Figura 3B) amplifica una banda única ~ 1,2 Kbp en PCR5 como se ve en los clones 4, 7, 9, 11 y 12 (Figura 3C). Si HXGPRT no se elimina de la locus, un ~ 3.Se observa una banda de 4 Kbp (clones 1, 2, 3, 6, 8, 10, y el control parental). Varios mecanismos actúan para hacer que la eliminación de HXGPRT (6TX selección) más difícil y menos eficaz que la integración de HXGPRT (MPA + X de selección). Selección MPA es simplemente más eficiente que 6TX selección 14,16. Además, se necesitan niveles más altos de expresión HXGPRT para la selección 6TX que para selecciones de AMP 16,24. En consecuencia, las mutaciones que pueden reducir la actividad enzimática HXGPRT o mutaciones o cambios epigenéticos que reducen el nivel de expresión de HXGPRT en el locus de un gen potencialmente pueden abolir la eficacia de la selección 6TX. Incluso con estos retos de selección 6TX, la tasa de éxito de la selección 6TX en cepas Δ Ku80 es mayor que 90% en el primer intento 1-3. Se muestra un esquema general para el etiquetado directo de C-terminal de la proteína-codificación de los genes (Figura 4). Esteesquema utiliza la integración directa a través de doble cruz sobre la recombinación homóloga de HXGPRT 3 &#39;del gen marcado y también emplea estrategias de validación similares a los descritos anteriormente. Cuando un gen se sospecha que es un gen esencial esto puede ser verificado utilizando una segunda transfección con un plásmido aislado de forma independiente focalización ADN. Otros métodos, como los planes para la expresión de genes regulados, están disponibles para comprobar aún más si un gen es esencial 25. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figura 1. Descripción general del diseño de un plásmido de ADN de direccionamiento. Una. Esquema para el diseño de superposición cebadores utilizados para amplificar por PCR el 5 &#39;y 3&#39; con los flancos de destino 33 se superpone pb para el vector lanzadera de pRS416 y casete de minigén HXGPRT. Los cebadores representados en el esquema eranutilizado para generar el 5 &#39;y 3&#39; flancos objetivo de pΔROP18 10. B. Estrategia general para el diseño de una molécula de ADN de direccionamiento. La columna vertebral de pΔGOI es el pRS416 vector lanzadera que contiene uracilo (URA) y ampicilina (AMP) marcadores de selección. Insertado en pRS416 es un ~ 1 kbp 5 &#39;del ADN flanco diana amplificado a partir de ADN genómico con superposiciones para el casete de minigén HXGPRT y pRS416 usando los cebadores F1 y R1, un ~ 1 Kbp 3&#39; flanco ADN diana se amplifica a partir de ADN genómico con superposiciones para el casete minigen HXGPRT y pRS416 utilizando los primers F2 y R2 y el casete minigen HXGPRT. Los siguientes sitios de restricción de enzimas digieren únicas se agregan a los cebadores: RE.X (enzima de restricción sitio de corte X) en el cebador F1 para cortar el plásmido en el extremo 5 &#39;de la 5&#39; ADN flanco de destino, en el RE.Y R2 imprimación para cortar el plásmido en &#39;final de la 3&#39; del ADN de flanco 3 de destino y RE.Z en los cebadores R1 y F2 para escindir el HXGPRT mincasete Igene. C. Primer secuencias utilizadas para generar la construcción de la orientación para la supresión de rop18. Las regiones negrita corresponden a T. secuencia genómica gondii, y las regiones nonbold corresponden a los sitios de enzimas de restricción y las secuencias que se superponen con pRS416 y el casete de minigén HXGPRT. El primer par HX_F y HX_R amplifica el casete minigen HXGPRT 14. Los cebadores leen desde 5 &#39;a 3&#39;. Tabla adaptada de Fentress et al 10. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figura 2. Descripción general del protocolo para la eliminación de un gen utilizando HXGPRT. Una. Disruption de un GOI en la cepa ku80Δhxgprt Δ por un entrecruzamiento doble evento de recombinación homóloga utilizando un ~ 1 kbp 5 &#39;del ADN diana y un flanco ~ 1 Kbp 3&#39; flanco ADN objetivo en el plásmido pΔGOI. Una estrategia de PCR usando PCR1, PCR2, PCR3, PCR4 y (no a escala) se muestra que permite la verificación genotipo para validar los clones con la integración dirigida de HXGPRT y deleción del locus GOI. B. pares de cebadores representativos diseñada para validar la eliminación de rop18 . ROP18_DF y ROP18_DR amplifican PCR1, ROP18_ExF y ROP18_CxR amplifican PCR2, ROP18_CxF y DHFR_CxR amplifican PCR3 y DHFR_CxF y ROP18_CxR amplificar PCR4 (véase la Figura 2A). Los cebadores leen desde 5 &#39;a 3&#39;. Tabla adaptada de Fentress et al 10. C. Los resultados representativos de la validación de una deleción génica dirigida (rop18) utilizando HXGPRT. Después de la transfección del plásmido pΔROP18 en Δ ku80Δhxgprt y selección de MPA +X, X + AMP clones resistentes se analizaron para la supresión de rop18. El control cepa parental es positivo para la PCR 1 (~ 400 pb) y PCR 2 (~ 650 pb) del producto y negativo para la PCR 3 (~ 1200 pb) y PCR 4 (~ 1300 pb) del producto. Un nocaut GOI objetivo es positivo para los productos PCR2, PCR3 y PCR4 y es negativa para el producto de PCR 1 (véase la Figura 2A). Se muestra son los paneles representativos de los resultados de PCR1 y PCR2 (panel superior), PCR3 (panel medio) y PCR4 (panel inferior). Los clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 y 11 muestran el patrón de bandas correcta de la PCR 1, PCR2, PCR3 y PCR4 que define un evento de deleción dirigida de genes en el clon. Los clones 1, 2, 7, 10 y 12 no son supresiones de genes, y corresponden a otros resultados representativos potenciales. (C = control de la cepa parental Δ ku80Δhxgprt, M = marcadores de tamaño). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figura 3. Descripción general del protocolo para reorientar el gen de interés para borrar HXGPRT. A. Estrategia para la eliminación del marcador seleccionable HXGPRT por un entrecruzamiento doble evento de recombinación homóloga en la cepa Δ ku80Δgoi :: HXGPRT utilizando un ~ 1 kbp 5 &#39;del ADN diana y un flanco ~ 1 Kbp 3&#39; flanco ADN objetivo en el plásmido pΔGOIc. La estrategia de PCR para la verificación genotipo se representa utilizando un par de cebadores para el ensayo de un producto de PCR (PCR5) que se extiende por la deleción (no a escala). B. Un par de cebadores representante diseñada para validar la eliminación del marcador seleccionable HXGPRT de la gra2 locus en la cepa Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. cebadores gra2 _CLF y GRA2_CxR amplifican PCR5. Primers<html> leer de 5 &#39;a 3&#39; del panel. C. Representante de 6TX clones resistentes que se pueden obtener después de la transfección del plásmido pΔGOIc en Δ ku80Δgoi :: HXGPRT y selección en 6TX. Los clones 4, 7, 9, 11 y 12 exhiben el patrón de bandas correcta de PCR5 que corresponda a la eliminación específica del marcador HXGPRT (~ 1,2 Kbp producto que abarca &#39;flanco con ligero solapamiento con el 5&#39; de la 3 flanco y fuera de la 3 &#39; flanco). Los clones 1, 2, 3, 6, 8, y 10 (esta banda es la luz) representan el patrón de bandas esperado de alrededor de ~ 3,4 kbp que se corresponde con el genotipo clon parental, a pesar de que estos clones exhibieron un grado de resistencia a la 6TX que permitieron su selección (este fenotipo puede surgir espontáneamente de vez en cuando por el cierre de expresión HXGPRT (véase la nota en el protocolo 2.1 (paso 8) y la sección de resultados representativos). (C = cepa de control parental Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = marcadores de tamaño).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> La Figura 4. Diseño de una molécula de ADN de direccionamiento para etiquetar el extremo C-terminal de una proteína. La estrategia se basa en la capacidad del marcador de HXGPRT a funcionar también como región reguladora aguas abajo de un 3 &#39;. La columna vertebral de pΔGOItag es el pRS416 vector lanzadera que contiene uracilo (URA) y ampicilina (AMP) marcadores de selección. Insertado en pRS416 es un ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA flanquean diana amplificado a partir de ADN genómico con solapa de la cinta minigen HXGPRT y pRS416 utilizando el Fgoi y RTAG cebadores, a ~ 1 Kbp 3&#39; DNA flanquean diana se amplifica a partir del ADN genómico con solapa para el casete de minigén HXGPRT y pRS416 usando la F2 y R2cebadores y el casete minigen HXGPRT. El 5 &#39;ADN flanco destino reemplaza el codón de terminación con la etiqueta (HA, Myc, His, etc) seguido de un codón de terminación de reemplazo. AMP + X selección integra la etiqueta C-terminal y un HXGPRT aguas abajo, y mueve el 3 &#39;UTR a una posición tras el marcador HXGPRT. Los siguientes sitios de restricción de enzimas digieren únicas se agregan a los cebadores: RE.X (enzima de restricción sitio de corte X) en el cebador Fgoi para cortar el plásmido en el extremo 5 &#39;de la 5&#39; ADN flanco de destino, y en el RE.Y cebador R2 para cortar el plásmido en &#39;final de la 3&#39; del ADN de flanco 3 de destino, y en el RE.Z RTAG y los cebadores F2 para escindir el casete de minigén HXGPRT para su uso para la construcción de plásmidos para volver a apuntar el locus del gen etiquetado para eliminar el marcador HXGPRT que restaurará la colocación de la 3 &#39;UTR.

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Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Aquí se presenta un método para el uso de tipo I y tipo II<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas de<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Para generar de manera eficiente las supresiones de genes dirigidos y reemplazos de genes para el análisis genómico funcional.

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