Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH till DJB (AI041930, AI073142, AI075931 och AI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Här ger vi ett protokoll för effektiv genmålinriktning i Δ Ku80 parasitstammar att möjliggöra en effektiv återvinning av genetiskt manipulerade avkomma som har riktade gendeletioner, utbyten genen och / eller märkta gener. Den sekventiella utförandet av dessa metoder ger en tillförlitlig metod för isoleringen av parasiten mutanter som innehåller enkla eller multipla riktade genetiska manipulationer 1-3. Även skapandet av en riktad deletion beror på flera faktorer, ökar användningen av Δ Ku80 stammen med den presenterade strategin och protokoll kraftigt effektivitet och enkel att göra exakt definierade muterade stammar av T. gondii för funktionella genomiska studier. Genomet hos T. gondii under asexuella stadier är haploid. Således ett övervägande att göra när du planerar att ta bort en gen är att genen inte vara nödvändigt in vitro. Trots effektiviteten i siktating gen knockouts i Δ Ku80 stammar är extremt hög, och detta möjliggör isoleringen av muterade stammar med signifikant försämrad replikering priser. Om en riktad gen är viktig, parasiter upphör ofta att replikera under valet. En annan kritisk faktor riktad genmodifiering är det perfekta homologi med minst 620 bp av den genomiska inriktning flanken krävs för att erhålla detekterbara riktade integrationer 2. Längre homologiregioner ger högre effektivitet på inriktning och använda targeting DNA flanker ca 1000 bp är en pålitlig och effektiv metod 1-4. Av denna anledning är det viktigt att genomiska inriktning flankerna genereras från samma stam av T. gondii (RH, Pru) som den stam som är genetiskt manipulerad. Brist på tillräcklig homologi kan ofta leda till riktade åtgärder för integration av en genomisk inriktning flank, men inte den andra. Ofullständig integration eller underlåtenhet att skaffa en knockout may kan också bero på episomal uthållighet. Omedelbart efter transfektion, är alla de målsökande molekyler icke-integrerade episomer, och ibland målsökande molekyler kan kvarstå som episomer för många generationer. Använda flanker mål-DNA av ~ 1 Kbp och fortsätter att passera parasiter under selektion före re-underkloning ofta löser problem som är förknippade med episomal uthållighet. När en knockout valideras och HXGPRT markören tas bort, kan det genmålinriktning strategin upprepas på andra indiska myndigheterna att generera flera gendeletioner i en enda parasit stam 1-3. Genereringen av deletioner, utbyten, eller taggade gener kan också åstadkommas genom att använda olika selekterbara markörer (bleomycin, CAT, pyrimetamin resistent DHFR, etc.). Trots att CAT-selekterbara markören för närvarande är närvarande i typ II Δ Ku80 Pru genomet 1, kan denna markör tas bort med HXGPRT </em&gt; selection protokoll som beskrivs här. I våra händer, är HXGPRT valet den säkraste och mest effektiva markör med den högsta inriktning effektiviteten där en enda kopia riktad insättning är tillräcklig för robust val i MPA + X medium. HXGPRT ger också den enda närvarande användbar metod för målinriktad radering av ett selekterbar markör (figur 3) med användning av 6-tioxantin (6TX) urval 2,3. Således detta protokoll ger den enda nuvarande metoden för att utveckla definierade mutantstammar med flera riktade genetiska manipulationer. Detta protokoll ger en värdefull och effektiv metod för riktad genmodifiering i Δ Ku80 stammar av Toxoplasma gondii och gäller analys av en enda gen, en familj av gener, eller genomvida funktionella studier genomiska. Före tillgängligheten av Δ Ku80 stammar 1,2, var dessa metoder inte är allmänt möjligt på grund inefficiency av dessa metoder. Följaktligen är detta protokoll brett tillämpbar för riktad genmodifiering av Toxoplasma gondii och är tillgänglig för alla utredare intresserade hanterar en rad frågor om parasiten biologi, värdrespons och funktionsgenomik.

Toxoplasma gondii är en vanlig obligat intracellulär protozo parasit som ofta och kroniskt infekterar en rad olika djur och människor 5. Det uppskattas att mer än 1 miljard människor är närvarande och kroniskt smittade av denna patogen. Förutom vikten av sjukdom orsakad av T. gondii-infektion, den ökade tillgången på experimentella verktyg, kraftfulla genomik resurser 6, enkel in vitro tillväxt och utmärkta modeller mus har gjort T. gondii en ledande modell för den bredare studie av intracellulära eukaryota patogener och andra viktiga parasiter apicomplexan som orsakar förödande sjukdomar såsom malaria (Plasmodium sp.) och Cryptosporidios (Cryptosporidium) 5,7. En betydande begränsning av Toxoplasma gondii som modell organism har varit ineffektiv återvinning av avkomma som bär riktade genetiska manipulationer. Denna problematiskm Riktad genmodifiering beror på en låg frekvens av homolog rekombination i förhållande till den mycket höga frekvensen av icke-homolog rekombination i vildtyp stammar av T. gondii även när omfattande DNA-homologi finns i DNA-molekyler mål används i genetiska studier 2. Vi har nyligen genetiskt blockerade viktig väg av icke-homolog rekombination i typ I och typ II-stammar av Toxoplasma gondii genom att ta bort genen som kodar för proteinet Ku80 1,2. Den erhållna typ I och typ II Δ Ku80 stammar uppvisar normala tillväxt, storlek och beteende både in vitro och in vivo under tachyzoite och bradyzoite stadier in vitro och in vivo, men dessa stammar uppvisar i huvudsak en 100% frekvens av homolog rekombination och detta fenotyp ökar sannolikheten för snabbt önskade isolera avkomma av riktade genetiska manipulationer med flera hundra till flera thousand-faldig 1,2,4. Senaste community-bred användning av typ I och typ II Δ Ku80 stammar har betydligt ramped upp tempot, sorten, liksom andelen framgångsrika riktade genetiska strategier i T. gondii 1-4,8-13. Här beskriver vi ett omfattande protokoll för målinriktad gendeletion, genutbyte, och genen taggning i Δ Ku80 stammar av T. gondii. Vi visar hur man designar och tillförlitligt rikta genetiska manipulationer till specifika gener eller genetiska loci i Δ Ku80 stammar av Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Riktad genmodifiering använder homolog rekombination är den metod som föredras för funktionell genomisk analys för att få en detaljerad vy av geners funktion och fenotyp (s). Utvecklingen av muterade stammar med riktade gendeletioner, riktade mutationer, kompletterade genfunktionen, och / eller märkta gener ger kraftfulla strategier för att ta itu geners funktion, särskilt om dessa genetiska manipulationer effektivt kan riktas till genlokus intressepunkt med integration förmedlad genom att dubbelklicka gå över homolog rekombination. På grund av mycket höga nonhomologous rekombination, funktionell genomisk analys av Toxoplasma gondii har tidigare begränsats av bristen på effektiva metoder för inriktning gendeletioner och ersättare gen till specifika genetiska loci. Nyligen, avskaffade vi den stora vägen för icke-homolog rekombination i typ I och typ II stammar av T. gondii genom att ta bort genen encoding den Ku80 proteinet 1,2. De Δku80 stammarna beter normalt under tachyzoite (akut) och bradyzoite (kronisk) stadier in vitro och in vivo och uppvisar i huvudsak en 100% frekvens av homolog rekombination. De Δ Ku80 stammar gör funktionella genomiska studier genomförbart på enstaka gen samt på genomet skala 1-4. Här rapporterar vi metoder för att använda typ I och typ II Δku80Δhxgprt stammar att avancera genmålinriktning strategier i T. gondii. Vi beskriva effektiva metoder för att generera gendeletioner, utbyten genen och taggade gener genom riktade införande eller borttagande av hypoxantin-xantin-guaninfosforibosyltransferas (HXGPRT) valbar markör. Den beskrivna genmålsökning protokoll kan användas i en mängd olika sätt i Δku80 stammar till för funktionell analys av parasiten genomet och att utveckla enstaka stammar som bärflera riktade genetiska manipulationer. Tillämpningen av denna genetiska metod och efterföljande fenotypiska analyser kommer att avslöja grundläggande och unika aspekter av biologi T. gondii och tillhörande viktiga mänskliga patogener som orsakar malaria (Plasmodium sp.) och kryptosporidios (Cryptosporidium).

En detaljerad mall är anordnad för att konstruera en målsökande plasmid för att ta bort en gen, inklusive placeringen av restriktionsenzymställen och generering av de primrar som underlättar genetisk målinriktning och validering av genmålsökning, såväl som plasmidkonstruktion för efterföljande deletion av HXGPRT i en enstegsprocess (figurerna 1A-C, figur 2a, figur 3A). En generell schematisk presenteras för att göra en riktad gendeletion (figur 2A), de primerpar som används för att godkänna raderingen av en knockout, till exempel, är typ I rop18 (Figur 2B), och representativa resultat av PCR-validering visas (Figur 2C). Detta representativa Resultatet visas för att illustrera de olika resultat som kan erhållas från genetiska ställen som är relativt svåra att målet. Ett framgångsrikt riktad gendeletion kommer att resultera i frånvaro av genen av itresse PCR-produkten (PCR 1), närvaron av 3&#39;-genomiska targeting flank (PCR2), och närvaron av den HXGPRT selekterbara markören integreras ordentligt mellan de 5 &#39;och 3&#39; genomiska riktade flanker som definierar deletion (PCR3 och pCR4) . Klonerna 3, 4, 5, 6, 8, 9 och 11 är validerade riktade gendeletioner (knockouts) där HXGPRT har ersatt de indiska myndigheterna (figur 2C). En klon som inte innehåller en gendeletion kan representeras av en mängd olika bandmönster. Typiskt kommer en klon utan en gendeletion spegla moderstammen (föräldra-mönster) med band observerade för PCR1 och PCR2, men inte för PCR 3 eller pCR4 som seen för klonerna 1 och 2 (figur 2C). Denna &quot;föräldrarnas mönster&quot; uppstår från några potentiella orsakerna. Ibland, MPA resistenta utvalda parasiter bära icke-integrerade ihållande episomer av pΔGOI målsökningsplasmiden, och vi noterar att fortsatta urvalet ofta tvingar dessa episomeratt integrera. Vi följer också några sällsynta bakgrund i typ I Δ Ku80 stam grund oavsiktlig integration av pΔGOI målsökningsplasmiden, som innehåller ett HXGPRT cDNA uttrycks via DHFR 5 &#39;och 3&#39; element promotor, i antingen DHFR locus eller i den delvis raderade HXGPRT locus 14. Även denna sällsynta händelse är en riktad integration, var det inte den avsedda integrationen och fungerar som en viktig punkt att komma ihåg att utforma en strategi genersättning. DNA homologi större än 120 bp transporteras på din pΔGOI målsökningsplasmiden kan ge en alternativ plats för rekombination i Δ Ku80 stammar 2 som skulle kunna ge tillbaka en oönskad bakgrund. I typ II Pru Δ Ku80 stam denna bakgrund är nedsatt eller obefintlig jämfört med typ I eftersom HXGPRT valbar markör är baserad på typ I-sekvenser som har nucleotidepolymorphisms jämfört med typ II-DNA somreducerar kraftigt denna ovanliga bakgrund genom försök med typ II Pru Δ Ku80 stam 1. Om en gen locus är viktigt (kan inte raderas), eller har en extremt låg genmålinriktning frekvens på stället, eller om kvarstående [icke-integrerade] episomer inte lätt elimineras via tillväxt och urval kommer detta föräldrarnas mönster dominerar mönster som observerats i MPA resistenta kloner. Alternativt är den målsöknings-DNA-molekylen observeras ibland att integrera på endast 5&#39;-eller 3&#39;-genomiska targeting flank och ett band observeras för antingen PCR3 eller pCR4 (men inte båda) tillsammans med PCR1 och PCR2 som seen för klon 10 (5 &quot;integration) och klon 7 (3 &#39;integration) (figur 2C). Dessa mönster tyder den ovanliga förekomsten av en enda kors över integreringen av målsökningsplasmiden på stället som integrerar HXGPRT men detta riktade integration inte bort genen av intresse. Detta mönster (spår 7 och 10 i figur 2C) emphasizes behovet att rapportera PCR data för att verifiera att riktad integration inträffade stället för en enda korsa homolog över och en andra icke-homolog integration av den målinriktande molekylen. Sällan ser vi en genetisk blandning representeras av klon 12 (figur 2C) som representerar både ett föräldra mönster och en målinriktad radering mönster. Detta mönster sannolikt uppstår ibland från två parasit genotyper som finns på samma plats i en kloning väl. Ett allmänt schema för avlägsnande av HXGPRT från Δ ku80Δgoi :: HXGPRT att radera HXGPRT från stammen visas (figur 3A). Den primerpar används för att validera avlägsnandet av HXGPRT från Δ Ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (figur 3B) förstärker en unik ~ 1,2 Kbp bandet i PCR5 såsom framgår av kloner 4, 7, 9, 11 och 12 (fig 3C). Om HXGPRT inte avlägsnas från locus, en ~ 3.4 Kbp band observeras (kloner 1, 2, 3, 6, 8, 10, och föräldrakontroll). Flera mekanismer agera för att göra avlägsnandet av HXGPRT (6TX selektion) mer utmanande och mindre effektiv än integrationen av HXGPRT (MPA + X selektion). MPA val är helt enkelt effektivare än 6TX urval 14,16. Dessutom är högre nivåer av HXGPRT uttryck behövs för 6TX urval än för MPA markeringar 16,24. Följaktligen kan mutationer som kan minska HXGPRT enzymaktivitet eller mutationer eller epigenetiska förändringar som minskar expressionsnivån av HXGPRT vid en genens lokus avskaffa potentiellt effektivitet 6TX urval. Även med dessa utmaningar 6TX val, är andelen framgångsrika 6TX val i Δ Ku80 stammar mer än 90% på första försöket 1-3. Ett allmänt schema för direkt C-terminal taggning av protein-kodande gener visas (Figur 4). Dettaschema använder direkt integration via dubbel cross over homolog rekombination av HXGPRT 3 &#39;hos den märkta genen och även sysselsätter validering strategier liknande de som beskrivits ovan. När en gen misstänks vara en viktig gen detta kan verifieras med hjälp av en andra transfektion med ett självständigt isolerade inriktning DNA-plasmid. Alternativa metoder, såsom system för reglerad genuttryck, finns tillgängliga för ytterligare kontroll om en gen är avgörande 25. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Figur 1. Översikt över utformningen av en målsöknings-DNA-plasmid. A. Schematisk för att utforma överlappar primers som används för PCR amplifiering av 5 &#39;och 3&#39; flanker mål med 33 bp överlappningar för pRS416 skyttelvektorn och HXGPRT miniatyrgen kassett. Primrar som avbildas i den schematiska varanvänds för att generera 5&#39;-och 3&#39;-mål-flanker pΔROP18 10. B. Allmän strategi för att utforma en målsöknings-DNA-molekyl. Ryggraden i pΔGOI är pRS416 skyttelvektorn innehållande uracil (URA) och ampicillin (AMP) selekterbara markörer. Insatt i pRS416 är en ~ 1 kbp 5 &#39;DNA-mål flank förstärks från genomiska DNA med överlappningar för HXGPRT minigenen kassetten och pRS416 med F1 och R1 primers, en ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-mål flank förstärks från genomiska DNA med överlappningar den HXGPRT minigenen kassetten och pRS416 använda F2 och R2 primers och HXGPRT miniatyrgen kassett. Följande unika restriktionsenzymställen digest platser läggs till primrarna: RE.X (restriktionsenzym X cut plats) i F1-primer för att skära plasmiden vid 5&#39;-änden av 5&#39;-DNA-målet flank, RE.Y i R2 primer för att skära plasmiden vid 3&#39;-änden av 3&#39;-DNA-målet flank och RE.Z i R1 och F2 primrar för att skära ut HXGPRT minigene kassett. C. Primersekvenser används för att generera målkonstruktionen för radering av rop18. De djärva regionerna motsvarar T. gondii genomisk sekvens, och de nonbold regionerna motsvarar restriktionsenzymställena och sekvenser som överlappar med pRS416 och HXGPRT minigenen kassetten. Den HX_F och HX_R primerpar amplifierar HXGPRT minigen kassetten 14. Primrar läses från 5 &#39;till 3&#39;. Tabell anpassat från Fentress et al 10. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Figur 2. Översikt av protokollet för radering av en gen med hjälp HXGPRT. A. Disruption av en indiska i Δ ku80Δhxgprt stammen genom en dubbel crossover homolog rekombination med en ~ 1 kbp 5 &#39;flank DNA-mål och en ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-mål flank på plasmid pΔGOI. En PCR-strategi med PCR1, PCR2, PCR3 och pCR4 (ej skalenligt) visas som möjliggör genotyp verifiering att validera kloner med riktade åtgärder för integration av HXGPRT och radering av de indiska myndigheterna locus. Utformad för att godkänna raderingen av rop18 B. Representativa primerparen . ROP18_DF och ROP18_DR amplifiera PCR1, ROP18_ExF och ROP18_CxR amplifiera PCR2, ROP18_CxF och DHFR_CxR amplifiera PCR3 och DHFR_CxF och ROP18_CxR amplifiera pCR4 (se Figur 2A). Primrar läses från 5 &#39;till 3&#39;. Tabell anpassat från Fentress et al 10. C. Representativa resultat av validering av en riktad gendeletion (rop18) använder HXGPRT. Efter transfektion av plasmid pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt och val i MPA +X, MPA + X resistenta kloner analyserades för radering av rop18. Ursprungsstammen kontroll är positivt för PCR 1 (~ 400 bp) och PCR 2 (~ 650 bp) produkt och negativa för PCR 3 (~ 1200 bp) och PCR 4 (~ 1300 bp) produkt. En riktad GOI knockout är positivt för de PCR2, PCR3 och pCR4 produkter och är negativt för PCR 1 produkt (se Figur 2A). Visas är representativa paneler av resultaten av PCR1 och PCR2 (övre panelen), PCR3 (mellersta panel), och pCR4 (nedre panelen). Kloner 3, 4, 5, 6, 8, 9 och 11 uppvisar den korrekta bandmönster av PCR 1, PCR2, PCR3 och pCR4 som definierar en riktad händelse gendeletion i klonen. Klonerna 1, 2, 7, 10 och 12 är inte gendeletioner, och motsvarar andra potentiella representativa resultat. (C = föräldrakontroll stam Δ ku80Δhxgprt, M = storlek markörer). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att visa en större bild</a> . <img alt="Figur 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Figur 3. Översikt av protokollet för re-targeting genen av intresse att radera HXGPRT. A. Strategi för avlägsnande av HXGPRT markör med en dubbel crossover homolog rekombination i stammen Δ ku80Δgoi :: HXGPRT använder en ~ 1 kbp 5 &#39;flank DNA-mål och en ~ 1 kbp 3&#39; DNA-mål flank på plasmid pΔGOIc. Den PCR-strategi för genotyp verifiering avbildas användning av ett primerpar till analys för en PCR-produkt (PCR5) som spänner över deletionen (ej skalenlig). En representativ primerpar utformade att validera avlägsnandet av HXGPRT selekterbara markören från gra2 B. locus i stam Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF och GRA2_CxR amplifiera PCR5. Primrar<html> läsa från 5 &#39;till 3&#39;. C. representativ panel av 6TX-resistenta kloner som kan erhållas efter transfektion av plasmid pΔGOIc in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT och val i 6TX. Kloner 4, 7, 9, 11 och 12 uppvisar den korrekta bandmönster av PCR5 som motsvarar riktad deletion av HXGPRT markör (~ 1,2 Kbp produkt som spänner över 3&#39;-flanken med liten överlappning med 5&#39;-flank och utanför 3&#39; flank). Klonerna 1, 2, 3, 6, 8 och 10 (detta band är ljus) visar den förväntade bandmönster på omkring ~ 3,4 Kbp som motsvarar den parentala klonen genotypen, även om dessa kloner uppvisade en viss grad av motstånd mot 6TX som tillät deras val (denna fenotyp kan ibland uppstå spontant genom avstängning av HXGPRT uttryck (se not i protokoll 2.1 (steg 8) och resultat Representant avsnitt). (C = föräldrakontroll stam Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = storlek markörer).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicka här för att visa en större bild. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Figur 4. Designen av en målsöknings-DNA-molekyl för att märka den C-terminala änden av ett protein. Strategin bygger på förmågan hos den HXGPRT markör för att även fungera som ett 3&#39;-nedströms regulatorisk region. Ryggraden i pΔGOItag är pRS416 skyttelvektorn innehållande uracil (URA) och ampicillin (AMP) selekterbara markörer. Insatt i pRS416 är en ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-mål flank förstärks från genomiska DNA med överlappningar för HXGPRT minigenen kassetten och pRS416 med Fgoi och Rtag primers, en ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-mål flanken förstärks från genomiska DNA med överlappningar den HXGPRT minigenen kassetten och pRS416 med F2 och R2primers och HXGPRT miniatyrgen kassetten. 5&#39;-DNA-mål flanken ersätter termineringskodonen med taggen (HA, Myc, His, etc) följt av en ersättare termineringskodon. MPA + X val integrerar den C-terminala taggen och en nedströms HXGPRT, och flyttar 3 &#39;UTR till en position efter den HXGPRT markör. Följande unika restriktionsenzymställen digest platser läggs till primrarna: RE.X (restriktionsenzym X cut plats) i Fgoi primer för att skära plasmiden vid 5&#39;-änden av 5&#39;-DNA-målet flank, och RE.Y i R2 primer för att skära plasmiden vid 3&#39;-änden av 3&#39;-DNA-målet flank, och RE.Z i Rtag och F2 primrar för att skära ut HXGPRT minigen kassett för användning för plasmidkonstruktion för att omorientera den taggade genlokus för att radera den HXGPRT markör som kommer att återställa placeringen av 3&#39;-ITR.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation in ÃŽâ€ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii at JoVE.com

Genetic Manipulation in ÃƒÅ½Ã¢â‚¬Âku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Här rapporterar vi ett förfarande för användning av typ I och typ II<em&gt; Δku80</em&gt; Stammar av<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Att effektivt generera riktade gendeletioner och ersättare genen för funktionell genomisk analys.

Genetisk manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammar för funktionell genomik Analys av<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Skaffa renat Toxoplasma gondii Oocystor av kontinuerliga cesiumklorid Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cysta Wall Bildning i aktiverade härledd från benmärg makrofager och Bradyzoite Villkor

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Möss med fördefinierade Receptor T cellspecifika Against Toxoplasma gondii Erhållits via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

DNA-fingeravtryck av Mycobacterium leprae Stammar genom olika Upprepa Antal Tandem (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

En genetisk skärm för att isolera Toxoplasma gondii Host-cell avstigning mutanter

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Framåt genetiska metoder i<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Efter i realtid konsekvens av Pneumococcal Virulensfaktorer i en akut Mus Lunginflammation Modell Använda självlysande bakterier

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Realtid avbildning av myeloida celler Dynamics i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Tarmtumörer genom Spinning Disk konfokalmikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃƒÅ½Ã‚Â³-Dependent Cell Autonomous Immunity

Framåt Genetics skärmar Använda makrofager att identifiera<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Viktigt för Resistance till IFN-γ beroende cell autonoma immunitet

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...