Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

1.. Infektion af makrofager med H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 timer før infektion, frø makrofager ved ønskede densitet i 24-brønds plader. I denne protokol, blev en tæthed på 3,0 x 10 5 celler / godt brugt. </li><li> Tilføj svampeceller i log-vækstfase ved en ønsket flerhed af infektion (MOI). Denne protokol kan rumme en række MOI (0,2-5,0). Til infektion RAW264.7 makrofager med H. capsulatum, brugte vi en MOI på 0,2. </li><li> Efter 1,5 timer for at tillade fagocytose,...

<ol>
	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+yeast:+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays.">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li><li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry.">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li><li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry.">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry.">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

Billede cytometri tillader brugeren at fange billeder i høj kvalitet og ved hjælp af specialiseret software, udføre en hurtig kvantificering af celler. Én potentiel udfordring til vedtagelsen af ​​billedet cytometri inden for mikrobiel patogenese er, at mikrober, der skal tælles, er til stede i en blandet population af celler, herunder pattedyrværtsceller. Her viser vi, at billedet cytometri kan anvendes til kvantificering af levedygtige patogene gær under in vitro makrofag infektion. Vores metodolog...

Undersøgelser af patogene svampe i samarbejde med deres værter og / eller værtsceller kræver ofte kvantificering af levedygtige svampeceller over en kursus eller under forskellige infektion forhold. Tælling af kolonidannende enheder (CFU) er den standard metode, hvorved antallet af levedygtige svampeceller er blevet målt, men denne teknik har flere ulemper og begrænsninger. Først, mange svampearter vokser langsomt. Vækst af synlige kolonier på faste medier kan tage 1-2 uger, hvilket er betydeligt langsommere tempo for forskningen. For det andet, manipulation af prøver i løbet af CFU plating er en møjsommelig proces, da flere fortyndinger skal belagt for at sikre et tælleligt antal kolonier. Det tredje er antallet af CFU er typisk lavere end antallet af levedygtige belagt organismer fordi udpladningseffektiviteten er godt under 100%. For eksempel kan plating effektivitet for den dimorfe svampepatogenet Histoplasma capsulatum være så høj som 90%, men er rutinemæssigt så lav som30%, og er endnu lavere (10%) for den relaterede svampe dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Udpladningseffektivitet for Candida albicans er også genstand for variation 3.. Endelig CFU analyse tegner sig kun for levende og aktivt delende celler kan godtgøre vækst på faste medier, mens der i mange situationer vil det være nyttigt at bestemme tilstedeværelsen og koncentrationen af ​​døde og / eller metabolisk inaktive celler. Tidligere har flowcytometriske metoder til kvantificering af adskillige patogene svampearter blevet beskrevet 4-6. Men på grund biosikkerhed indeslutning problemer forbundet med at bruge biosikkerhed niveau 2 (BSL2) eller BSL3 niveau patogener på fælles flowcytometre, har vedtagelsen af ​​denne teknik været begrænset. Ligesom flowcytometri, er billedet cytometri en følsom og hurtig metode til celle kvantificering. Dog kan billede cytometri udføres på en brøkdel af omkostningerne med sammenlignelige resultater 7 -11.. Her beskriver vi fremgangsmåder til udførelse billede cytometri af patogene svampe i forbindelse med værtsceller. Vi viser vores metoder ved hjælp af to humane patogene svampe: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum er en dimorf svampepatogen der forårsager respiratorisk sygdom, hos mennesker, vokser det som spirende gær og gentagelser inden alveolære makrofager Candida albicans er et menneske kommensale arter, der lejlighedsvis forårsager candidiasis.. Vi viser, at billedet cytometri tillader hurtig kvantificering af disse gærtyper, sammen med visualisering kapacitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

Undersøgelser af de cellulære patogenese mekanismer patogene gær såsom Candida albicans, Histoplasma capsulatum, og Cryptococcus neoformans almindeligvis anvender infektion af mammale værter eller værtsceller (dvs. makrofager) efterfulgt af gær kvantificering hjælp kolonidannende enhed analyse eller flowcytometri. Mens kolonidannende enhed tælling har været den mest anvendte metode i marken, denne teknik har ulemper og begrænsninger, herunder langsom vækst i nogle svampearter på faste medier og lave og / eller variabel plating effektivitet, som er af særlig bekymring, når man sammenligner vækst af vildtype og mutant stammer. Flowcytometri kan levere hurtige kvantitative oplysninger om gær levedygtighed, har dog vedtagelse af flowcytometrisk detektion for patogene gær været begrænset til en række praktiske årsager, herunder høje omkostninger og biosikkerhed overvejelser. Her viser vi et billede-baseretcytometrisk metode bruger Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) til kvantificering af levedygtige patogene gær i co-kultur med makrofager. Vore undersøgelser fokuserer på påvisning af to humane patogene svampe: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum koloniserer alveolære makrofager ved at replikere i makrofager fagosomet, og her, vi kvantitativt vurdere væksten af H. capsulatum gær i RAW 264,7 makrofager ved hjælp acridinorange / propidiumiodid-farvning i kombination med billedet cytometri. Vores metode trofast redegør væksttendenser som målt ved traditionel kolonidannende enhed tælling, men med væsentligt forøget følsomhed. Desuden har vi direkte vurdere infektion af levende makrofager med et GFP-udtrykkende stamme af C. albicans. Vores metode tilbyder en hurtig, præcis og økonomisk midler til detektion og kvantificering af vigtige menneskelige svampepatogener i samarbejde with værtsceller.

Vi brugte Cellometer Vision billedet cytometer til at overvåge vækst H. capsulatum i macrofagceller. RAW 264.7-celler blev inficeret med H. capsulatum gærceller og på forskellige tidspunkter blev prøver underkastet AO / PI farvning efterfulgt af image-baserede cytometri. Sideløbende blev prøver analyseret ved traditionel CFU tælling. På hvert tidspunkt blev prøver inkuberet i vand for at lysere makrofager, og de ​​befriede gærceller blev identificeret ved Cellometer Vision Software <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Her viser vi, hvordan billedet cytometri kan anvendes til kvantificering af patogene svampe i forbindelse med værtsceller i kultur. Denne teknik kan anvendes som et alternativ til CFU tælling.

Brug af Image Cytometry til kvantificering af patogene svampe i forbindelse med Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi Metoder til bestemmelse af levedygtighed Bakterier i foreningen med pattedvrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-baserede Flowcytometri Teknik at vurdere ændringer i granulocyt Function<em&gt; In vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis som model organisme for vurdering Interaktion af anaerobe bakterier med værtsceller

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Brug af flowcytometri at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

En avanceret murine model for alkoholfri steatohepatitis i forbindelse med type 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...