Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

1. זיהום של המקרופאגים עם ח&#39; capsulatum, ג אלביקנס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 שעות לפני ההדבקה, מקרופאגים זרעים בצפיפות רצויה ב24 גם צלחות. בפרוטוקול זה, צפיפות של 3.0 x 10 5 תאים / גם הייתה בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תאים פטרייתי?...

<ol>
	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+yeast:+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays.">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li><li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry.">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li><li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry.">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry.">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

cytometry התמונה מאפשרת למשתמש ללכוד תמונות באיכות גבוהות, ובאמצעות תוכנה מיוחדת, לבצע כימות מהירה של תאים. אתגר אחד פוטנציאל לאימוץ cytometry תמונה בתחום פתוגנזה של חיידקים הוא שהחיידקים שנספרו נמצאים באוכלוסייה מעורבת של תאים, כולל תאי מארח יונקים. כאן, אנו מראים כי cytometry ת?...

מחקרים של פטריות פתוגניים בשיתוף עם המארחים ו / או תאי מארח שלהם לעתים קרובות דורשים כימות של תאים פטרייתיים קיימא לאורך זמן או כמובן בתנאי זיהום שונים. ספירה של יחידות מושבה להרכיב (CFU) היא השיטה הסטנדרטית שבו מספר התאים פטרייתיים קיימא כבר נמדד, לעומת זאת, טכניקה זו יש כמה חסרונות ומגבלות. ראשית, הרבה מיני פטריות הם בצמיחה איטית. צמיחה של מושבות גלויות על תקשורת מוצקה יכולה לקחת 1-2 שבועות, להאט את קצב המחקר באופן משמעותי. שנית, מניפולציה של דגימות במהלך ציפוי CFU היא תהליך מייגע, שכן כמה דילולים חייבים להיות מצופה על מנת להבטיח מספר מנייה של מושבות. שלישית, מספר CFU הוא בדרך כלל נמוך יותר ממספר אורגניזמים קיימא מצופים בגלל יעילות הציפוי היא גם מתחת ל -100%. לדוגמה, ביעילות ציפוי לcapsulatum Histoplasma הפתוגן פטרייתי דימורפית יכולה להיות גבוהה ככל 90%, אך באופן שגרתי הן נמוכות כמו30% והם נמוכים אף יותר (10%) לdimorph brasiliensis הקשור פטרייתי Paracoccidioides 1, 2. ציפוי יעיל לקנדידה אלביקנס כפוף גם לשונות 3. לבסוף, ניתוח CFU מהווה רק תאי חיים ופעילים המסוגלים חלוקת ביסוס צמיחה על תקשורת מוצקה, ואילו במצבים רבים, זה יהיה שימושי כדי לקבוע את הנוכחות והריכוז של תאים מתים שאינם פעילים ו / או חילוף חומרים. בעבר, שיטות תזרים cytometric לכימות של כמה מיני פטריות פתוגניים תוארה 4-6. עם זאת, בשל בעיות בלימת biosafety מעורבות עם השימוש בפתוגנים BSL3 ברמת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) או על cytometers זרימה משותף, האימוץ של טכניקה זו היה מוגבל. כמו cytometry הזרימה, cytometry התמונה הוא שיטה רגישה ומהירה של תא כימות. עם זאת, ניתן לבצע cytometry תמונה בכל חלק של העלות עם תוצאות דומות 7 -11. כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע cytometry תמונה של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח. אנו מדגימים את השיטות שלנו באמצעות שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח&#39;. capsulatum הוא פתוגן פטרייתי דימורפית שגורם למחלות בדרכי הנשימה, בבני אדם, שהוא גדל שמרי ניצנים וכמשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים קנדידה אלביקנס הוא מין commensal אדם שלעתים גורם לקנדידה.. אנו מראים כי cytometry התמונה מאפשרת כימות מהירה של שמרים אלה, יחד עם יכולת הדמיה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

מחקרים של מנגנוני פתוגנזה הסלולר של שמרים פתוגניים כגון קנדידה אלביקנס, capsulatum Histoplasma, וneoformans Cryptococcus להעסיק זיהום של מארחים יונקים או תאים מארחים (כלומר מקרופאגים) ואחריו כימות שמרים באמצעות מושבה להרכיב יחידת ניתוח או cytometry זרימה בדרך כלל. בעוד ספירת יחידת המושבה להרכיב כבר את השיטה הנפוצה ביותר בתחום, יש לו טכניקה זו חסרונות ומגבלות, כולל צמיחה איטית של כמה מיני פטריות על תקשורת מוצקה ויעילות ציפוי נמוכה ו / או משתנה, וזה מדאיג במיוחד כאשר משווה צמיחה של זני הבר מסוג והמוטציה. cytometry הזרימה יכול לספק מידע כמותי לגבי כדאיות שמרים מהיר, לעומת זאת, האימוץ של גילוי תזרים cytometric לשמרים פתוגניים היה מוגבל למספר סיבות מעשיות הכולל עלות הגבוהה שלה ושיקולי biosafety. הנה, אנחנו מדגימים מבוססי תמונההמתודולוגיה cytometric באמצעות חזון Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) לכימות של שמרים פתוגניים קיימא בשיתוף התרבות עם מקרופאגים. המחקרים שלנו להתמקד בזיהוי של שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח&#39;. capsulatum colonizes מקרופאגים מכתשיים ידי שכפול בתוך phagosome מקרופאג, והנה, אנו כמותית להעריך את הצמיחה של ה שמרי capsulatum ב264.7 מקרופאגים RAW באמצעות acridine כתום / מכתים יודיד propidium בשילוב עם cytometry תמונה. השיטה שלנו בנאמנות מגמות צמיחה כפי שהיא נמדדת על ידי משחזרת מושבה מסורתית ויצרה ספירת יחידה, אבל עם רגישות מוגברת באופן משמעותי. בנוסף, אנו ישירות להעריך זיהום של מקרופאגים לחיות עם זן ה-GFP-לבטא של ג אלביקנס. המתודולוגיה שלנו מציעה אמצעי מהיר, מדויק וחסכוני לאיתור וכימות של פתוגנים פטרייתי אדם חשובים בשנינות העמותהתאי מארח h.

אנחנו השתמשנו cytometer תמונת חזון Cellometer לפקח צמיחה של ה capsulatum בתאי macrophage. 264.7 תאי RAW היו נגועים בח&#39; תאי שמרי capsulatum ובנקודות זמן שונים, דגימות היו נתונים לצביעת AO / PI ואחרי ניתוח cytometric מבוסס תמונה. במקביל, דגימות נותחו על ידי ספירת CFU מסורתית. בכל נקודת זמן, דג...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

הערכה כמותית של תאים חיסוניים רקמות חוט השדרה נפגע על ידי זרימת cytometry: השתמש חדשנית שיטת טיהור Cell

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte<em&gt; במבחנה</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

מודל Murine מתקדם לאגודה לדלקת כבד Nonatoin עם סוכרת מסוג 2

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...