Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
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1。 H.とマクロファージの感染カプスラーツム、C.アルビカンス <ol><li> 16感染前にHR、24ウェルプレート中で所望の密度でシードマクロファージ。このプロトコルでは、ウェル3.0×10 5細胞の密度/を使用した。 </li><li>感染の所望多重度（MOI）で対数増殖期における真菌細胞を追加します。このプロトコルは、MOI（ - 5.0 0.2）の範囲を収容することができます。 H.とRAW...

<ol>
	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+yeast:+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays.">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li><li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry.">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li><li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry.">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry.">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

イメージサイトメトリーにより、ユーザは高品質の画像をキャプチャし、特殊なソフトウェアを使用して、細胞の迅速な定量化を行うことができる。病原微生物学分野における画像メトリーの適用つの潜在的課題は、カウントされる微生物は、哺乳動物宿主細胞を含む細胞の混合集団中に存在することである。ここでは、イメージサイトメトリーをin vitroマクロファージ感染中?...

彼らのホストおよび/または宿主細胞に伴う病原性真菌の研究は、多くの場合、時間経過を介して、または別の感染条件下で実行可能な真菌細胞の定量化を必要とする。コロニー形成単位（CFU）の列挙は、生菌数を測定したが、この手法はいくつかの欠点と限界を有することによって標準的な方法である。まず、多くの真菌種は成長が遅いです。固体培地上に見えるコロニーの成長が著しく、研究のペースを遅くする、1〜2週間かかる場合があります。いくつかの希釈がコロニーの可算数を確保するためにメッキしなければならないので、第二に、CFUメッキ中にサンプルの操作は、骨の折れるプロセスです。メッキ効率がよく、100％を下回っているので、第三に、CFU数が蒔い生菌の数よりも一般的に低くなっています。例えば、二形真菌病原体ヒストプラスマカプするめっき効率は90％と高いよいが、日常的な限り低くすることができ30％とは、関連する真菌dimorphのParacoccidioidesのパラゴムノキ 1、2のために（10％）であっても低くなっています。 カンジダ用めっき効率も変動3の対象となります。最後に、固体培地上で成長を確立することができる唯一の​​ライブと活発に分裂する細胞のためのCFU分析アカウントは、多くの状況で、一方、それは死んで、および/または代謝的に不活性な細胞の存在と濃度を決定することは有用であろう。 以前は、いくつかの病原性真菌種の定量化のためのフローサイトメトリーの方法は4-6に記載されている。ただし、共有フローサイトメーター上のバイオセーフティレベル2（BSL2）またはBSL3レベルの病原体の使用に関わるバイオセーフティ封じ込めの問題のために、この手法の採用が限定されている。フローサイトメトリーのように、イメージサイトメトリーは、細胞の定量化の感度かつ迅速な方法である。しかし、画像サイトメトリーを同等の結果7と数分の一のコストで行うことができます-11。ここでは、宿主細胞に伴って病原性真菌のイメージサイトメトリーを実行するための方法が記載されている。我々は2つの人間の真菌病原体を使用して、私たちの方法を実証： ヒストプラスマカプとカンジダをH.。カプは、呼吸器疾患を引き起こす二形真菌病原体であり、ヒトでは、出芽酵母として成長し、肺胞マクロファージ内で複製カンジダは時折カンジダ症の原因となる人間の共生種である。我々は、画像メトリが可視化機能と一緒に、これらの酵母の迅速な定量化を可能にすることを示している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

例えば、 カンジダ·アルビカンス 、 ヒストプラスマカプ 、およびクリプトコッカス·ネオフォルマンスなどの病原性酵母の細胞病原性機構の研究は、一般に、単位分析またはフローサイトメトリーを形成するコロニーを用いて酵母定量化に続いて、哺乳動物宿主又は宿主細胞（ すなわち、マクロファージ）の感染を用いる。コロニー形成単位の列挙は、フィールドで最も一般的に使用される方法であったが、この技術は成長を比較するときに特に懸念される固体培地および低および/または可変メッキ効率、上のいくつかの真菌種のゆっくりとした成長を含めて、不利な点と制限があります野生型および変異株である。フローサイトメトリーは、酵母の生存率に関する迅速な定量的情報を提供することができるが、病原性酵母のフローサイトメトリー検出の適用は、その高コスト及び生物学的安全性の考慮を含む実用的な理由の数が限られている。ここでは、イメージベースのデモンストレーションマクロファージとの共培養中の生存病原性酵母の定量化のためのCellometerビジョン（バイオサイエンスNexcelom、LLC）を使用してフローサイトメトリーの方法論。 2人間の真菌病原体の検出に関する我々の研究の焦点： ヒストプラスマカプとカンジダH.。カプはマクロファージファゴソーム内で複製することによって肺胞マクロファージコロニーを形成し、ここで、我々は定量H.の成長を評価するイメージサイトメトリーと組み合わせて、アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム染色を用いてRAW 264.7マクロファージにおけるカプ酵母。我々の忠実方法従来のコロニー形成単位の列挙によって測定された反復するの成長傾向が、大幅に増加した感度。さらに、我々は直接Cの GFP発現株でライブマクロファージの感染性を評価アルビカンス 。我々の方法論は、アソシエーションのウィットに重要なヒトの真菌病原体の検出および定量のために、迅速、正確、かつ経済的な手段を提供しています時間宿主細胞。

我々は、H.の成長を監視するCellometerビジョン画像サイトメーターを用いマクロファージ細胞内カプスラーツム 。 RAW 264.7細胞はH.に感染していたカプ酵母細胞及び様々な時点で、サンプルは画像ベースのサイトメトリー解析に続いAO / PI染色を行った。並行して、サンプルは、従来のCFU列挙によって分析した。各時点において、サンプルは、マクロファージを溶解す?...

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Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

ここでは、イメージサイトメトリー、培養中の宿主細胞に対応付けて病原性真菌の定量に使用することができる方法を示す。この技術は、CFU列挙の代替として使用することができる。

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術<em&gt;インビトロ</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

宿主細胞と嫌気性菌の相互作用を評価するためのモデル生物としてポルフィロモナス・ジンジバリス

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

2型糖尿病と関連した非アルコール性脂肪性肝炎のための高度なマウスモデル

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...