Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

En. Infeksjon av makrofager med H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 timer før infeksjon, frø makrofager på ønskede tetthet i 24-brønners plater. I denne protokollen, ble en densitet på 3,0 x 10 5 celler / brønn benyttes. </li><li> Legg soppcellene i log-fase vekst på et ønsket mangfold av infeksjon (MOI). Denne protokollen kan romme en rekke MOI (0,2 til 5,0). For infeksjon av RAW264.7 makrofager med H. capsulatum, brukte vi en MOI på 0,2. </li><li> Etter 1,5 timer for å till...

<ol>
	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+yeast:+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays.">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li><li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry.">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li><li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry.">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry.">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

Bilde cytometry tillater brukeren å fange bilder av høy kvalitet, og ved hjelp av spesialisert programvare, utføre rask kvantifisering av celler. Et potensielt utfordring til innføringen av bildecytometri innen mikrobiell patogenesen er at mikrobene som skal telles er tilstede i en blandet populasjon av celler, inkludert pattedyr-vertsceller. Her viser vi at bildecytometri kan anvendes for kvantifisering av levedyktige patogene gjær i løpet av in vitro-makrofag-infeksjon. Vår metodikk ikke bare trofast s...

Studier av patogene sopp i forbindelse med sine verter og / eller vertscellene ofte krever kvantifisering av levedyktige soppcellene over en tid kurs eller under ulike infeksjon forhold. Telling av kolonidannende enheter (CFU) er den standard metode hvor antallet levedyktige soppceller er blitt målt, er imidlertid denne teknikk flere ulemper og begrensninger. Først mange sopparter er saktevoksende. Vekst av synlige kolonier på faste medier kan ta 1-2 uker, betydelig bremse tempoet i forskning. For det andre er håndtering av prøvene under CFU Plating en arbeidskrevende prosess, siden flere fortynninger må være belagt for å sikre en tellende antall kolonier. For det tredje er det antall CFU vanligvis lavere enn antallet levedyktige organismer pletteres fordi pletteringen effektivitet er godt under 100%. For eksempel kan plating effektivitet for den dimorf patogen sopp Histoplasma capsulatum være så høyt som 90%, men er så lav som rutinemessig30% og er enda lavere (10%) for den relaterte sopp dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Plating effektivitet for Candida albicans er også gjenstand for variasjon tre. Endelig står CFU analyse for bare levende og aktivt delende celler i stand til å etablere vekst på faste medier, mens det i mange situasjoner, vil det være nyttig for å bestemme tilstedeværelsen og konsentrasjon av døde og / eller metaboliske inaktive celler. Tidligere har flowcytometrisk metoder for kvantifisering av flere patogene sopparter blitt beskrevet 4-6. Men på grunn av biosikkerhet containment problemer involvert med å bruke biosikkerhet nivå 2 (BSL2) eller BSL3-nivå patogener på delte flowcytometere har vedtakelsen av denne teknikken vært begrenset. Som strømningscytometri, er bildecytometri en sensitiv og rask metode for celle kvantifisering. Imidlertid kan bildecytometri utføres ved en brøkdel av kostnaden med sammenlignbare resultater 7 -11. Her beskriver vi metoder for å utføre bildecytometri av patogene sopper i assosiasjon med vertsceller. Vi viser våre metoder ved hjelp av to menneskelige sopp-patogener: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum er en dimorphic sopp patogen som forårsaker luftveissykdommer, hos mennesker, vokser det som spirende gjær og replikerer i alveolære makrofager Candida albicans er en menneskelig commensal arter som tidvis forårsaker candida.. Vi viser at bildecytometri tillater hurtig kvantifisering av disse gjær, sammen med visualisering evne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

Studier av de cellulære patogenese mekanismer for sykdomsfremkallende gjærsopp som Candida albicans, Histoplasma capsulatum, og Cryptococcus neoformans ofte ansette infeksjon av pattedyr verter eller vert celler (dvs. makrofager) etterfulgt av gjær kvantifisering ved hjelp av kolonidannende enhet analyse eller flowcytometri. Mens kolonidannende enhet opplisting har vært den mest brukte metoden i felten, har denne teknikken ulemper og begrensninger, inkludert treg vekst av enkelte sopparter på faste medier og lav og / eller variabel Plating effektivitet, som er spesielt opptatt av når man sammenligner vekst av villtype og mutant stammer. Flowcytometri kan gi rask kvantitativ informasjon om gjær levedyktighet har imidlertid innføringen av strømningscytometrisk deteksjon for patogene gjærsopp vært begrenset for en rekke praktiske grunner, inkludert den høye prisen og biosikkerhet hensyn. Her viser vi et bilde-basertecytometrisk metodikk bruker Cellometer Vision (Nexcelom biovitenskap, LLC) for kvantifisering av levedyktige patogene gjærsopp i co-kultur med makrofager. Våre studier fokuserer på deteksjon av to menneskelige sopp-patogener: Histoplasma capsulatum og Candida albicans H.. capsulatum koloniserer alveolære makrofager ved å kopiere innenfor makrofag phagosome, og her har vi kvantitativt vurdere veksten av H. capsulatum gjær i RAW 264,7 makrofager ved hjelp acridine oransje / propidium iodide farging i kombinasjon med bildet cytometry. Vår metode trofast sammenfatter vekst trender målt ved tradisjonelle kolonidannende enhet opplisting, men med betydelig økt følsomhet. I tillegg har vi direkte vurdere infeksjon av levende makrofager med GFP-uttrykke stamme av C. albicans. Vår metodikk tilbyr en rask, nøyaktig og økonomiske midler for påvisning og kvantifisering av viktige menneskelige sopp-patogener i foreningen viddh vertsceller.

Vi brukte Cellometer Vision image cytometer å overvåke veksten av H. capsulatum i makrofager. RAW 264,7 celler ble infisert med H. capsulatum gjærceller og ved forskjellige tidspunkter ble prøver underkastet AO / PI farging etterfulgt av bildebasert cytometrisk analyse. Parallelt ble prøvene analysert av tradisjonell CFU telling. På hvert tidspunkt ble prøver inkubert i vann for å lysere makrofager, og de ​​frigjorte Gjærcellene ble identifisert ved Cellometer Vision programvare (f...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Her viser kor bildecytometri kan anvendes for kvantifisering av patogene sopper i assosiasjon med vertsceller i kultur. Denne teknikken kan brukes som et alternativ til CFU oppregning.

Bruk av bildecytometri for kvantifisering av patogene sopper i foreningen med Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Bildebasert flowcytometrisystemer Technique å evaluere Endringer i Granulocytt Funksjon<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis som modellorganisme for Assessing Interaksjon av anaerobe bakterier med vertsceller

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Bruk av flowcytometrisystemer å vurdere tilstanden til Chromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarget flyt cytometri-baserte kvantifisering av mitokondrier og lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

En avansert murine modell for alkoholfrie steatohepatitis i samarbeid med type 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Utarbeidelse av hele benmarg for Mass flowcytometri analyse av nøytrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...