Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
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1. Infecção de macrófagos com H. capsulatum, Candida albicans <ol><li> 16 horas antes da infecção, os macrófagos de sementes com uma densidade desejada em placas de 24 poços. Neste protocolo, foi utilizada uma densidade de 3,0 x 10 5 células / poço. </li><li> Adicionar células fúngicas em crescimento de fase log a uma multiplicidade desejada de infecção (MOI). Este protocolo pode acomodar uma gama de MOI (0,2-5,0). Para a infecção de macrófagos RAW264.7 com H. capsulatum, f...

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	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+yeast:+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays.">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li><li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry.">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li><li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry.">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry.">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

Citometria de imagem permite ao usuário capturar imagens de alta qualidade e, usando um software especializado, realizar rápida quantificação de células. Um desafio potencial para a adopção de citometria de imagem no domínio da patogênese microbiana é que os microrganismos sejam contados presente numa população mista de células, incluindo células hospedeiras de mamífero. Aqui, demonstramos que a citometria de imagem pode ser utilizada para a quantificação de leveduras patogénicas viáveis ​​durante...

Estudos de fungos patogénicos em associação com os seus hospedeiros e / ou células hospedeiras exigem frequentemente a quantificação de células de fungos viáveis ​​ao longo de um curso de tempo ou sob diferentes condições de infecção. Enumeração das unidades formadoras de colónias (UFC) é o método padrão pelo qual o número de células de fungos viáveis ​​foi medida, no entanto, esta técnica tem várias desvantagens e limitações. Em primeiro lugar, muitas espécies de fungos são de crescimento lento. O crescimento das colônias visíveis em meios sólidos pode levar 1-2 semanas, diminuindo significativamente o ritmo da investigação. Por outro lado, a manipulação de amostras durante CFU chapeamento é um processo laborioso, uma vez que várias diluições deve ser revestida para garantir um número de colónias contáveis. Em terceiro lugar, o número de UFC é tipicamente menor do que o número de organismos viáveis ​​plaqueadas porque a eficiência de plaqueamento é bem abaixo de 100%. Por exemplo, a eficiência de revestimento para o dimórfico Histoplasma capsulatum patógeno fúngico pode ser tão alto como 90%, mas são habitualmente tão acessível quanto30% e são ainda mais baixos (10%) para o fungo relacionado Dimorfa Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Eficiência chapeamento de Candida albicans também está sujeito à variabilidade 3. Finalmente, a análise de CFU representa apenas as células vivas e dividindo activamente capazes de estabelecer o crescimento em meios sólidos, ao passo que, em muitas situações, pode ser útil para determinar a presença e concentração de células mortas inactivos e / ou metabolicamente. Anteriormente, os métodos de citometria de fluxo para a quantificação de várias espécies de fungos patogénicos tem sido descrita 4-6. No entanto, devido a questões de biossegurança de contenção envolvidos com o uso de nível de biossegurança 2 (BSL2) ou patógenos de nível BSL3 em cytometers fluxo compartilhados, a adoção dessa técnica tem sido limitada. Como citometria de fluxo, citometria de imagem é um método sensível e rápido de quantificação celular. No entanto, a imagem de citometria pode ser realizada a uma fracção do custo com resultados comparáveis ​​7 -11. Aqui, descrevemos os métodos para a realização de citometria de imagem de fungos patogênicos em associação com células hospedeiras. Nós demonstramos nossos métodos usando dois fungos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum e Candida albicans H.. capsulatum é um fungo dimórfico que causa doença respiratória, em seres humanos, que cresce levedura como brotamento e replica no interior de macrófagos alveolares Candida albicans é uma espécie comensais humanos que provoca ocasionalmente candidíase.. Nós mostramos que a citometria de imagem permite uma rápida quantificação dessas leveduras, juntamente com a capacidade de visualização.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

Estudos dos mecanismos de patogênese celulares de leveduras patogênicas como a Candida albicans, Histoplasma capsulatum e Cryptococcus neoformans comumente empregam infecção de hospedeiros mamíferos ou células hospedeiras (ou seja, macrófagos), seguido pela quantificação de leveduras utilizando análise de unidade formadora de colônia ou citometria de fluxo. Enquanto a unidade de formação de colónia enumeração tem sido o método mais comummente utilizado no campo, esta técnica tem as desvantagens e limitações, incluindo crescimento lento de algumas espécies de fungos em meios sólidos e eficiências de baixo e / ou variável de revestimento, que é de preocupação particular quando se compara o crescimento de estirpes de tipo selvagem e mutante. A citometria de fluxo podem proporcionar informação quantitativa rápida quanto viabilidade celular, no entanto, a adopção de citometria de fluxo para a detecção de leveduras patogénicas tem sido limitada por um número de razões práticas, incluindo o seu elevado custo e as considerações de biossegurança. Aqui, nós demonstramos uma baseada em imagemmetodologia de citometria usando a visão Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC), para a quantificação de leveduras patogênicos em co-cultura com macrófagos. Nossos estudos concentram-se na detecção de dois fungos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum e Candida albicans H.. capsulatum coloniza macrófagos alveolares, replicando dentro do fagossoma do macrófago, e aqui, nós quantitativamente avaliar o crescimento de H. leveduras capsulatum em RAW 264,7 macrófagos usando laranja de acridina / coloração iodeto de propídio em combinação com a citometria de imagem. Nosso método fielmente recapitula as tendências de crescimento, medida pela unidade formadora de colônia tradicional enumeração, mas com um aumento significativo de sensibilidade. Além disso, avaliar diretamente a infecção de macrófagos ao vivo com uma cepa GFP-expressando de C. albicans. Nossa metodologia oferece um meio rápido, preciso e econômico para a detecção e quantificação de importantes fungos patógenos humanos em associação sagacidadeAs células hospedeiras h.

Usamos o Cellometer Visão imagem citômetro para monitorar o crescimento de H. capsulatum do macrófago. Células RAW 264.7 foram infectados com H. células de levedura capsulatum e em vários pontos de tempo, as amostras foram submetidas a AO / PI coloração seguida por análise de citometria de imagem baseado. Em paralelo, as amostras foram analisadas por contagem de CFU tradicional. Em cada ponto de tempo, as amostras foram incubadas em água para lisar os macrófagos e as células de lev...

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Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Aqui, demonstramos como citometria de imagem pode ser usada para quantificação de fungos patogénicos em associação com as células hospedeiras em cultura. Esta técnica pode ser usado como uma alternativa para CFU enumeração.

Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Avaliação quantitativa das células imunes no tecido medula lesionada por Citometria de Fluxo: um novo uso para um método de purificação celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Imunologia e Infecção

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescência métodos de microscopia para determinar a viabilidade de bactérias em associação com células de mamíferos

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Um modelo murino avançado para esteatohepatite não alcoólica em associação com diabetes tipo 2

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Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...