Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

1. Инфицирование макрофагов H. capsulatum, C. Albicans <ol><li> 16 часа до инфицирования, семена макрофагов при желаемой плотности в 24-луночных планшетах. В этом протоколе, плотность 3,0 х 10 5 клеток / лунка была использована. </li><li> Добавить грибковые клетки в логарифмической фазе роста в желае?...

<ol>
	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+yeast:+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays.">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li><li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry.">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li><li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry.">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry.">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

Изображение цитометрии позволяет пользователю захватить высокое качество изображения и, используя специализированное программное обеспечение, выполнить быстрое количественное клеток. Один потенциальный вызов принятием изображения цитометрии в области микробного патогенеза явля?...

Исследования патогенных грибов в связи с их хозяев и / или клетки-хозяева, часто требуют количественного жизнеспособных клеток грибов за время курса или в других условиях инфекции. Перечень колониеобразующих единиц (КОЕ) представляет собой стандартный метод, посредством которого количество жизнеспособных клеток грибов были измерены, однако, этот метод имеет ряд недостатков и ограничений. Во-первых, многие виды грибов растут медленно. Рост видимые колонии на твердой среде может занять 1-2 недели, что значительно замедляет темпы научных исследований. Во-вторых, манипуляции образцов в процессе покрытия КОЕ это трудоемкий процесс, так как несколько разведения должны быть покрыты для обеспечения счетного числа колоний. В-третьих, количество КОЕ, как правило, ниже, чем количество жизнеспособных организмов покрытием, так как покрытие эффективность значительно ниже 100%. Например, покрытие для эффективности диморфными грибкового патогена Histoplasma capsulatum может быть выше, чем 90%, но обычно по цене от30% и даже ниже (10%) для соответствующих грибковых диморф Paracoccidioides Brasiliensis 1, 2. Покрытие эффективности Candida Albicans также подвержен изменчивости 3. Наконец, анализ КОЕ составляет только живых и активно делящиеся клетки, способные устанавливать роста на твердой среде, в то время как во многих ситуациях, было бы полезно, чтобы определить наличие и концентрацию мертвыми и / или метаболически неактивные клетки. Ранее методов проточной цитометрии для количественного определения нескольких патогенных видов грибов были описаны 4-6. Однако из-за биобезопасности сдерживания проблемы при использовании уровня биобезопасности 2 (BSL2) или BSL3 уровня патогенов на общих цитометрах потока, принятие эта техника была ограничена. Как проточной цитометрии, изображения цитометрии является чувствительным и быстрый метод клеточной количественной оценке. Тем не менее, изображение цитометрии могут быть выполнены в часть стоимости с аналогичными результатами 7 -11. Здесь мы описываем методы для выполнения изображение цитометрии патогенных грибков в сочетании с клетками-хозяевами. Мы демонстрируем наши методы с использованием двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum является диморфными грибкового патогена, вызывающих респираторные заболевания, а в людях, он растет как начинающим дрожжей и повторяет в альвеолярных макрофагах Candida Albicans является человеком синантропных видов, которые иногда вызывает кандидоз.. Мы покажем, что изображения цитометрии позволяет быстрое количественное эти дрожжи, вместе с визуализацией возможности.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

Исследования клеточных механизмов патогенеза патогенные дрожжи, такие как Candida Albicans, Histoplasma capsulatum и Cryptococcus neoformans обычно используют заражение хозяев-млекопитающих или клетки-хозяева (т.е. макрофаги) с последующим использованием дрожжей количественного анализа колониеобразующих единицы или проточной цитометрии. В то время как колониеобразующие единицы перечисление была наиболее широко используемый метод в данной области, этот метод имеет недостатки и ограничения, в том числе медленный рост некоторых видов грибов на твердой среде и низкой и / или переменной эффективности покрытие, которое представляет особый интерес при сравнении роста дикого типа и мутантных штаммов. Проточная цитометрия может обеспечить быстрое количественной информации о дрожжи жизнеспособности, однако, применение проточной цитометрии обнаружения патогенных дрожжей было ограничено по ряду практических причин, включая его высокой стоимости и биологической соображений. Здесь мы демонстрируем на основе образацитометрические методологии с использованием Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience ООО) для количественного определения жизнеспособных патогенных дрожжей в совместной культуре с макрофагами. Наши исследования направлены на выявление двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum колонизирует альвеолярных макрофагов путем репликации в макрофагах фагосома, и здесь, мы количественно оценить рост H. capsulatum дрожжей в RAW 264.7 макрофагами использованием акридиноранжа / пропидий йодида окрашивания в сочетании с изображения цитометрии. Наш метод точно повторяет тенденции роста как измеряется традиционными колониеобразующая единица перечисления, но со значительно более высокой чувствительностью. Кроме того, мы непосредственно оценить инфекции живых макрофагов с GFP-экспрессирующих штамм C. Albicans. Наша методика предлагает быстрое, точное и экономичное средство для обнаружения и количественного определения важных человеческих патогенных грибов в остроумии ассоциациич клетки хозяина.

Мы использовали Cellometer цитометром изображения видения для контроля роста H. capsulatum в клетки макрофагов. RAW 264.7 клетки были инфицированы H. capsulatum дрожжевых клетках и в различные моменты времени, образцы подвергали AO / PI последующим окрашиванием на основе изображения цитометрии. Па...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Здесь показано, как изображение цитометрии может использоваться для количественного определения патогенных грибов в связи с хост клеток в культуре. Этот метод может быть использован в качестве альтернативы перечисление КОЕ.

Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Количественная оценка иммунных клеток в поврежденный спинной ткани шнура с помощью проточной цитометрии: Роман Используйте для метода очистки сотовый

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Изображение на основе проточной цитометрии Методика оценки изменений в Гранулоцита функции<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis в качестве модельного организма для оценки интерактивности анаэробных бактерий с клеток-хозяев

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Использование проточной цитометрии для оценки состояния хроматина в Т-клетках

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Расширенный murine модель безалкогольный стеатогепатит в ассоциации с сахарным диабетом 2 типа

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Подготовка цельного костного мозга для анализа массовой цитометрии нейтрофил-линейных клеток

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...