Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
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1. La infección de macrófagos con H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 horas antes de la infección, los macrófagos de semillas a la densidad deseada en placas de 24 pocillos. En este protocolo, se utilizó una densidad de células de 3,0 x 10 5 / pocillo. </li><li> Añadir células de hongos en crecimiento de fase log a una multiplicidad de infección deseada (MOI). Este protocolo se puede acomodar una variedad de MOI (0,2-5,0). Para la infección de macrófagos RAW264.7 con H. capsulatum...

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	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. 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R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

Citometría de imagen permite al usuario capturar imágenes de alta calidad y el uso de software especializado, realizar una rápida cuantificación de células. Un reto potencial para la adopción de la citometría de imagen en el campo de la patogénesis microbiana es que los microbios a ser contadas están presentes en una población mixta de células, incluyendo las células huésped de mamífero. Aquí, demostramos que la citometría de imagen se puede utilizar para la cuantificación de levaduras patógenas viable...

Estudios de hongos patógenos en asociación con sus anfitriones y / o células huésped a menudo requieren la cuantificación de células fúngicas viables durante un transcurso de tiempo o bajo diferentes condiciones de infección. Enumeración de las unidades formadoras de colonias (UFC) es el método estándar por el cual se ha medido el número de células de hongos viables, sin embargo, esta técnica tiene varios inconvenientes y limitaciones. En primer lugar, muchas especies de hongos son de crecimiento lento. El crecimiento de colonias visibles en medios sólidos puede tardar 1-2 semanas, disminuyendo significativamente el ritmo de la investigación. En segundo lugar, la manipulación de las muestras durante chapado UFC es un proceso laborioso, ya que varias diluciones deben ser chapados para asegurar un número contable de colonias. En tercer lugar, el número de UFC es típicamente menor que el número de organismos viables sembradas debido a que la eficiencia de plaqueo es muy por debajo de 100%. Por ejemplo, la eficiencia de la galjanoplastia para el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum patógeno puede ser tan alta como 90%, pero son habitualmente tan bajo como30% y son aún más baja (10%) para el relacionado con hongos dimorfo Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Eficiencia de plaqueo para Candida albicans también está sujeta a la variabilidad 3. Por último, el análisis de CFU representa sólo las células en vivo y dividiendo activamente capaces de establecer el crecimiento en medios sólidos, mientras que en muchas situaciones, sería útil para determinar la presencia y concentración de las células muertas inactivos y / o metabólicamente. Anteriormente, los métodos de citometría de flujo para la cuantificación de varias especies de hongos patógenos ha sido descrito 4-6. Sin embargo, debido a problemas de contención de bioseguridad relacionados con el uso de bioseguridad de nivel 2 (BSL2) o patógenos BSL3 nivel de citómetros de flujo compartidas, la adopción de esta técnica ha sido limitada. Al igual que la citometría de flujo, citometría de imagen es un método sensible y rápido de cuantificación celular. Sin embargo, la citometría de imagen se puede realizar a una fracción del costo con resultados comparables 7 -11. Aquí, se describen los métodos para realizar citometría de imagen de hongos patógenos en asociación con las células huésped. Demostramos nuestros métodos utilizando dos hongos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum y Candida albicans H.. capsulatum es un hongo patógeno dimórfico que causa la enfermedad de las vías respiratorias, en los seres humanos, que crece como levadura en ciernes y se replica dentro de los macrófagos alveolares Candida albicans es una especie comensal humanos, que en ocasiones causa la candidiasis.. Se demuestra que la citometría de imagen permite una rápida cuantificación de estas levaduras, junto con la capacidad de visualización.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

Los estudios sobre los mecanismos de la patogénesis celulares de levaduras patógenas tales como Candida albicans, Histoplasma capsulatum y Cryptococcus neoformans emplean comúnmente infección de huéspedes mamíferos o células huésped (es decir, los macrófagos), seguido por la cuantificación de levadura utilizando formadoras de colonias unidad de análisis o la citometría de flujo. Mientras unidad formadora de colonias enumeración ha sido el método más comúnmente utilizado en el campo, esta técnica tiene desventajas y limitaciones, incluyendo el crecimiento lento de algunas especies de hongos en medios sólidos y eficiencias bajas y / o variable de chapado, lo cual es de particular preocupación cuando se comparan el crecimiento de las cepas de tipo salvaje y mutante. La citometría de flujo puede proporcionar una rápida información cuantitativa con respecto a viabilidad de la levadura, sin embargo, la adopción de la detección de citometría de flujo para las levaduras patógenas se ha visto limitado por un número de razones prácticas, incluyendo su alto costo y las consideraciones de seguridad de la biotecnología. Este sentido, demuestran una imagen basada enmetodología de citometría de uso de la Visión Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) para la cuantificación de levaduras patógenas viables en co-cultivo con macrófagos. Nuestros estudios se centran en la detección de dos hongos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum y Candida albicans H.. capsulatum coloniza los macrófagos alveolares mediante la replicación dentro del fagosoma macrófagos, y aquí, nos cuantitativamente evaluar el crecimiento de H. levaduras capsulatum en RAW 264,7 macrófagos con naranja de acridina / tinción con yoduro de propidio en combinación con citometría de imagen. Nuestro método recapitula fielmente las tendencias de crecimiento, medido por unidad formadora de colonia tradicional enumeración, pero con un aumento significativo de sensibilidad. Además, se evalúa directamente la infección de los macrófagos en vivo con una cepa que expresa GFP de C. albicans. Nuestra metodología ofrece un medio rápido, preciso, y económico para la detección y cuantificación de hongos patógenos humanos importantes en asociación ingeniocélulas huésped h.

Se utilizó el Cellometer Vision imagen citómetro para controlar el crecimiento de H. capsulatum en células de macrófagos. Las células RAW 264.7 fueron infectados con H. células de levadura capsulatum y en varios puntos de tiempo, las muestras fueron sometidas a tinción AO / PI seguida de análisis de citometría basada en imágenes. En paralelo, las muestras se analizaron por enumeración tradicional UFC. En cada punto de tiempo, las muestras se incubaron en agua para lisar los macrófa...

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Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Aquí, demostramos cómo citometría de imagen se puede utilizar para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con células huésped en cultivo. Esta técnica se puede utilizar como una alternativa a la CFU enumeración.

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Evaluación cuantitativa de las células inmunes en el tejido de la médula espinal lesionada por citometría de flujo: un nuevo uso de un método de purificación celular

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescencia métodos de microscopía para determinar la viabilidad de las bacterias en asociación con las células de mamíferos

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

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Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Un modelo murino avanzado para esteatohepatitis no alcohólica en asociación con diabetes tipo 2

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Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

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