Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

Ett. Infektion av makrofager med H. capsulatum, C. albicans <ol><li> 16 h före infektion, utsäde makrofager vid önskad densitet i 24-brunnsplattor. I detta protokoll har en densitet av 3,0 x 10 5 celler / brunn användes. </li><li> Lägg svamp celler i log-fas tillväxt vid en önskad mångfald av infektion (MOI). Detta protokoll kan rymma en rad MOI (0,2-5,0). För infektion av RAW264.7 makrofager med H. capsulatum, använde vi en MOI på 0,2. </li><li> Efter 1,5 h för att möjliggör...

<ol>
	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+yeast:+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays.">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li><li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry.">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li><li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry.">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry.">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

Bild cytometry tillåter användaren att ta högkvalitativa bilder och med hjälp av specialiserad mjukvara, utföra snabba kvantifiering av celler. En potentiell utmaning till antagandet av bilden metri inom området för mikrobiell patogenes är att mikrober som ska räknas är närvarande i en blandad population av celler, inklusive däggdjursvärdceller. Här visar vi att bilden cytometri kan användas för kvantifiering av livsdugliga patogena jäst under in vitro makrofag infektion. Vår metodik inte bara...

Studier av patogena svampar i samband med sina värdar och / eller värdceller kräver ofta kvantifiering av livsdugliga svampceller under ett tidsförlopp eller under olika infektion förhållanden. Räkning av kolonibildande enheter (CFU) är standard metoden med vilken antalet livsdugliga svampceller har uppmätts, emellertid har denna teknik flera nackdelar och begränsningar. Först många svamparter växer långsamt. Tillväxten av synliga kolonier på fasta medier kan ta 1-2 veckor, betydligt långsammare takten i forskningen. Det andra är manipulation av prover under CFU plätering en mödosam process, eftersom flera utspädningar måste vara pläterad för att säkerställa en uppräknelig antal kolonier. Det tredje är antalet CFU vanligtvis lägre än antalet viabla utstrukna organismer eftersom utstrykningseffektivitet är väl under 100%. Exempelvis kan plätering verkningsgrader för dimorfa svamppatogen Histoplasma capsulatum vara så hög som 90%, men är rutinmässigt så lite som30% och är ännu lägre (10%) för den tillhörande svamp dimorf Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Utstrykningseffektivitet för Candida albicans är också föremål för variation 3. Slutligen står CFU analys för bara levande och aktivt delande celler med förmåga att skapa tillväxt på fasta medier, medan det i många situationer, skulle det vara lämpligt att fastställa förekomsten och koncentrationen av döda och / eller metaboliskt inaktiva celler. Tidigare har flödescytometriska metoder för kvantifiering av flera patogena svamparter har beskrivits 4-6. Men på grund av biosäkerhet inneslutning frågor som med hjälp av skyddsnivå 2 (BSL2) eller BSL3 nivå patogener på delade flödescytometrar, har antagandet av denna teknik varit begränsad. Liksom flödescytometri, är bilden cytometry en känslig och snabb metod för cell kvantifiering. Däremot kan bilden cytometri utföras på en bråkdel av kostnaden med jämförbara resultat 7 -11. Här beskriver vi metoder för att utföra bilden cytometri av patogena svampar i samband med värdceller. Vi visar våra metoder med två humana svamppatogener: Histoplasma capsulatum och Candida albicans H.. capsulatum är en dimorphic svamppatogen som orsakar respiratorisk sjukdom, hos människor, växer det så spirande jäst och replikerar i alveolära makrofager Candida albicans är en mänsklig commensal art som ibland orsakar candidiasis.. Vi visar att bilden cytometri tillåter snabb kvantifiering av dessa jäst, tillsammans med visualisering kapacitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

Studier av de cellulära patogenes mekanismer patogena jästsvampar såsom Candida albicans, Histoplasma capsulatum och Cryptococcus neoformans sysselsätter ofta infektion i mammalievärdar eller värdceller (dvs makrofager) följt av jäst kvantifiering med kolonibildande enhet analys eller flödescytometri. Medan kolonibildande enhet uppräkning har varit den vanligaste metoden inom området, har denna teknik nackdelar och begränsningar, inklusive långsamma tillväxten av vissa svamparter på fasta medier och låga och / eller varierande effektivitet plätering, vilket är särskilt oroande när man jämför tillväxten av vildtyp och mutanta stammar. Flödescytometri kan ge snabb kvantitativ information om jäst lönsamhet har dock anta flödescytometrisk detektion för patogena jästsvampar varit begränsade till ett antal praktiska skäl, inklusive dess höga kostnad och biosäkerhet överväganden. Här visar vi en bild-baseradcytometrisk metod med hjälp av den Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) för kvantifiering av livsdugliga patogena jäst i samodling med makrofager. Våra studier fokuserar på detektion av två humana svamppatogener: Histoplasma capsulatum och Candida albicans H.. capsulatum koloniserar alveolära makrofager genom att replikera i makrofager fagosomen, och här, vi kvantitativt bedöma tillväxten av H. capsulatum jäst i RAW 264.7 makrofager med akridinorange / propidiumjodidfärgning i kombination med bilden cytometry. Vår metod troget recapitulates trender tillväxt, mätt i traditionella kolonibildande enhet uppräkning, men med väsentligt ökad känslighet. Dessutom bedömer vi direkt infektion av levande makrofager med en GFP-uttryckande stam av C. albicans. Vår metodik ger snabb, korrekt och ekonomiskt medel för detektion och kvantifiering av viktiga mänskliga svamppatogener i samband with värdceller.

Vi använde Cellometer cytometer Vision bilden för att övervaka tillväxten av H. capsulatum i makrofagceller. RAW 264.7-celler infekterades med H. capsulatum jästceller och vid olika tidpunkter togs prover underkastades AO / PI-färgning följt av bildbaserad cytometrisk analys. Parallellt analyserades prover av traditionell CFU uppräkning. Vid varje tidpunkt togs prover inkuberades i vatten för att lysera makrofager, och de befriade jästcellerna identifierades genom Cellometer Vision mjukvara <...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Här visar vi hur bilden cytometri kan användas för kvantifiering av patogena svampar i association med värdceller i kultur. Denna teknik kan användas som ett alternativ till CFU uppräkning.

Användning av Image Cytometry för kvantifiering av patogena svampar i föreningen med värdceller

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Kvantitativ bedömning av immunceller i den skadade ryggmärg med flödescytometri: en ny användning för en cell reningsmetod

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Användning av en optisk fälla för studier av Host-patogen interaktioner för Dynamic levande cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Användning av EpiAirway modell för att karakterisera Långfristiga Värd-patogen interaktioner

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi Metoder för att fastställa livskraft bakterier i föreningen med däggdjursceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Bild-baserade flödescytometri Technique att utvärdera förändringar i Granulocyt Funktion<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis som modellorganism för att bedöma Interaktion av anaeroba bakterier med värdceller

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Användning av flödescytometri att bedöma staten Chromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor flöde flödescytometri-baserade kvantifiering av mitokondrier och lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

En avancerad murine modell för alkoholfria Steatohepatit i samband med typ 2 diabetes

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Beredning av hela benmärgen för Masscytometri analys av neutrofila-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...