Name: use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells
Uploaded: 2013-06-19T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

1. H. ile makrofajlar enfeksiyonu capsulatum, C. albicans <ol><li> Enfekte edilmeden önce, 16 saat, 24-yuvalı plakalar içinde istenilen yoğunlukta tohum makrofajlar. Bu protokol, iyi bir 3.0 x 10 5 hücre yoğunluğu / kullanıldı. </li><li> Bir enfeksiyon çokluğu istenen (İB) de log-fazı büyümesinde mantar hücreleri ekleyin. Bu protokol İçişleri Bakanlığı bir dizi (- 5.0 0.2) ağırlayacak. H. ile RAW264.7 makrofaj enfeksiyon için capsulatum, biz İçi...

<ol>
	<li>Worsham, P. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+plating+of+Histoplasma+capsulatum+without+addition+of+conditioned+medium+or+siderophores.">Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores.</a> J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).</li><li>Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).</li><li>Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+delivery+of+yeast+cells+as+an+explanation+for+reduced+plating+efficiency+of+Candida+albicans.">Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans.</a> Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).</li><li>Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantitation+of+yeast:+a+novel+technique+for+use+in+animal+model+work+and+in+vitro+immunologic+assays.">Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays.</a> Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).</li><li>Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+antifungal+activity+by+flow+cytometry.">Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).</li><li>Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+by+flow+cytometry.">Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+detection+method+for+apoptosis+and+necrosis+measurement+using+the+Cellometer+imaging+cytometry.">A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry.</a> Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).</li><li>Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+cytometry+method+for+autophagy+detection+in+living+cells.">A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells.</a> Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).</li><li>Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Image-based+Cytometry+for+Comparison+of+Fluorescent+Viability+Staining+Methods.">Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods.</a> Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+kinetic+measurements+of+rare+cell+proliferation+using+Cellometer+image-based+cytometry.">A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).</li><li>Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellometer+Vision+as+an+alternative+to+flow+cytometry+for+cell+cycle+analysis,+mitochondrial+potential,+and+immunophenotyping.">Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping.</a> Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).</li><li>Hull, C. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mating+type-like+locus+in+the+asexual+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans.</a> Science. 285, 1271-1275 (1999).</li><li>Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Quantification+of+Pathogenic+Fungi+by+Cellometer+Image-Based+Cytometry.">Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry.</a> J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).</li><li>Nguyen, V. Q., Sil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-induced+switch+to+the+pathogenic+yeast+form+of+Histoplasma+capsulatum+requires+Ryp1,+a+conserved+transcriptional+regulator.">Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).</li><li>Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+susceptibility+testing+of+fungi+by+flow+cytometry+using+vital+staining.">Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining.</a> Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).</li></ol>

Resim sitometri kullanıcı yüksek kaliteli çekim ve, özel yazılım kullanarak, hücrelerin hızlı ölçümü yapmak için izin verir. Mikrobiyal patogenez alanında görüntü sitometrisi benimsenmesine bir potansiyel bir sorun sayılması için mikrop memeli konak hücreleri arasında hücre, karışık bir popülasyonu içinde mevcut olmasıdır. Burada, görüntü sitometri in vitro makrofaj enfeksiyon sırasında canlı patojenik maya ölçümü için kullanılabilir olduğunu göstermektedir...

Kendi ana ve / veya ana hücreleri ile birlikte patojenik mantarların çalışmalar genellikle bir zaman boyunca veya farklı enfeksiyon koşullar altında canlı mantar hücreleri ölçümü gerektirir. Koloni oluşturan birim sayımı (CFU) uygun bir mantar hücre sayısı ölçülmüştür hangi standart bir yöntem olup, ancak bu teknik, çeşitli dezavantajları ve sınırlamaları vardır. İlk olarak, birçok mantar türleri yavaş büyüyen vardır. Katı ortam üzerinde görünür kolonilerin büyüme önemli ölçüde araştırma hızını yavaşlatan, 1-2 hafta sürebilir. Birkaç seyreltme kolonilerin sayılabilir miktarda sağlamak için kaplama gerekir çünkü ikinci, CFU kaplama sırasında örneklerin manipülasyon, zahmetli bir süreçtir. Kaplama verimi de% 100&#39;ün altında, çünkü Üçüncü olarak, CFU sayısını kaplama canlı organizmaların sayısı genellikle daha düşüktür. Örneğin, dimorfik fungal patojen Histoplasma capsulatum için kaplama verimliliği% 90 kadar yüksek olabilir, ama rutin olarak düşük olabilir% 30 ve ilgili mantar dimorph Paracoccidioides brasiliensis, 1, 2 (% 10) daha düşüktür. Candida albicans için kaplama verimi de değişkenlik 3 tabidir. Birçok durumda, bu ölü ve / veya metabolik olarak aktif olmayan hücrelerin varlığı ve konsantrasyonu belirlemek için yararlı olacaktır, oysa Son olarak, CFU analizi, katı ortam üzerinde büyüme oluflturabildikleri sadece canlı ve aktif olarak bölünen hücreler için hesaplar. Daha önce, çeşitli patojenik mantar türlerinin miktarının tayini için akış sitometrisi ile 4-6 yöntemler tarif edilmiştir. Ancak, paylaşılan akış sitometrelerinde biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) veya BSL3 düzeyinde patojenler ile ile ilgili biyogüvenlik muhafaza sorunları nedeniyle, bu tekniğin benimsenmesi sınırlı kalmıştır. Akım sitometri gibi, görüntü sitometri hücre miktarının bir hassas ve hızlı bir yöntemdir. Ancak, görüntü sitometri karşılaştırılabilir sonuçlar 7 ile maliyetinin bir kısmını yapılabilir -11. Burada, ev sahibi hücrelerle ilişkili olarak patojenik mantarların görüntü sitometrisi gerçekleştirmek için yöntemler tarif eder. Biz iki insan mantar patojenleri kullanarak yöntemleri göstermek: Histoplasma capsulatum ve Candida albicans H.. capsulatum solunum hastalığı neden olan bir dimorfik fungal patojendir, insanlarda, o kadar tomurcuklanan maya büyür ve makrofaj içinde çoğaltır Candida albicans bazen kandidiyazis neden olan bir insan ortakçı türdür.. Biz görüntü sitometri görselleştirme yeteneği ile birlikte, bu maya hızlı ölçümü sağlar olduğunu göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AO/PI Solution</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CSK-0102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Counting Chamber</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CHT4-SD100 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cellometer Vision Software</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of image cytometry for quantification of pathogenic fungi in association with host cells

Bu Candida albicans, Histoplasma capsulatum ve Cryptococcus neoformans gibi patojenik maya hücresel patogenezi mekanizmaların Çalışmaları genellikle birim analiz veya akım sitometri oluşturan koloni kullanarak maya miktar takip memeli ana veya ana hücreler (yani makrofajlar) enfeksiyonu kullanır. Koloni oluşturan birim numaralandırma alanında en sık kullanılan yöntem olsa da, bu tekniğin büyüme karşılaştırırken özellikle endişe vericidir katı ortam ve düşük ve / veya değişken kaplama verimliliği, bazı mantar türlerinin yavaş büyüme de dahil olmak üzere, dezavantajları ve sınırlamaları vardır Yabani tip ve mutant. Flow sitometri maya canlılığı ile ilgili hızlı bir niceliksel bilgi sağlayabilir, ancak, patojenik maya için akım sitometrik algılama benimsenmesinin yüksek maliyet ve biyogüvenlik konuları da dahil olmak üzere pratik nedenlerle bir dizi için sınırlı kalmıştır. Burada, bir görüntü tabanlı göstermekmakrofajlar ile birlikte kültür canlı patojenik maya ölçümü için Cellometer Vizyon (Bioscience Nexcelom, LLC) kullanarak sitometrik yöntem. Histoplasma capsulatum ve Candida albicans H.:. Çalışmalarımız iki insan fungal patojenlerin tespit odaklanmak capsulatum makrofaj phagosome içinde çoğaltarak makrofaj kolonize ve burada, biz kantitatif H. büyüme değerlendirmek görüntü sitometrisi ile birlikte akridin turuncu / propidyum iyodür boyaması kullanılarak bir RAW 264.7 makrofajlarda capsulatum mayalar. Bizim yöntemi sadakatle birim numaralandırma oluşturan geleneksel koloni ile ölçülen özetlediği büyüme trendleri, ancak önemli ölçüde artmış duyarlılık ile. Ayrıca, doğrudan C. bir GFP-ifade suşu ile canlı makrofaj enfeksiyonu değerlendirmek albicans. Bizim metodoloji ilişki zekâ önemli insan fungal patojenlerin tespiti ve ölçümü için bir, hızlı, doğru ve ekonomik bir araç sunuyors konakçı hücreler sunar.

Biz H. büyüme izlemek için Cellometer Vizyon görüntü sitometresinin kullanılır makrofaj hücrelerinde capsulatum. RAW 264.7 hücreleri H. ile enfekte edildi Çeşitli zaman noktalarında capsulatum maya hücreleri ve, örnekler görüntü-bazlı sitometrik analizi ile AO / PI boyama tabi tutuldu. Buna paralel olarak, örnekler geleneksel CFU numaralandırma ile analiz edildi. Her zaman noktasında, örnekler makrofajlar eritmek için su içinde inkübe edildi ve serbest kalan ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells at JoVE.com

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Burada, görüntü sitometrisi kültür ev sahibi hücrelerle ilişkili olarak patojenik mantarların ölçümü için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu teknik, CFU sayımı için bir alternatif olarak kullanılabilir.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dinamik Canlı Hücre Görüntüleme Konukçu-Patojen Etkileşimleri Çalışma Optik Tuzak

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Uzun vadeli Host-patojen Etkileşimleri karakterize EpiAirway Model kullanın.

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin<em&gt; İn Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

An Advanced Murine Model for Nonalcoholic Steatohepatitis in Association with Type 2 Diabetes

Tip 2 diyabet ile Ilişkisi olmayan alkollü steatohepatit için gelişmiş bir Murine modeli

Obesity is associated with chronic low-grade inflammation and insulin resistance, contributing to an increasing prevalence of chronic metabolic diseases, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...