Name: stereotaxic microinjection of viral vectors expressing cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Anni Lee und Maureen Byrne für ihre Hilfe danken, die Gründung der erweiterten Klimaanlage Platzpräferenz Protokoll.

Alle Vorgänge werden in Übereinstimmung mit dem Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care und Use Committee Regeln durchgeführt. 1. Vorbereitung und Einstellung für Stereotaktische Lieferung von viralen Vektoren <ol><li> Wenn ein Instrument, sterilen Tupfer oder Hand tragen sterile Handschuhe durch den Kontakt mit einem nicht-sterilen Oberfläche verschmutzt ist, verwerfen oder erneut sterilisieren das Instrument mit einem Wulst heißen Sterilisator, entsorgen Sie den Tup...

<ol>
	<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+neurobiology+of+addiction.">Molecular neurobiology of addiction.</a> American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).</li><li>Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system+and+cocaine+addiction.">Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction.</a> British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).</li><li>Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(v)1.2+L-Type+Ca2++Channels+Mediate+Cocaine-Induced+GluA1+Trafficking+in+the+Nucleus+Accumbens,+a+Long-Term+Adaptation+Dependent+on+Ventral+Tegmental+Area+Ca(v)1.3+Channels.">Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).</li><li>Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(v)1.3+L-type+Ca2++channels+mediate+long-term+adaptation+in+dopamine+D2L-mediated+GluA1+trafficking+in+the+dorsal+striatum+following+cocaine+exposure.">Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure.</a> Channels. 6 (1), 11-17 (2012).</li><li>Nestler, E. 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N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+Cre-recombinase+to+neurons+in+vivo+and+stable+transduction+of+neurons+using+adeno-associated+and+lentiviral+vectors+-+art.+no.+5.">Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5.</a> BMC Neuroscience. 5, (2004).</li><li>Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. 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J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene-expression+and+phenotypic+correction+using+adenoassociated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), (1994).</li><li>Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+activation+of+lateral+amygdala+pyramidal+cells+instructs+associative+fear+learning.">Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).</li><li>Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), (2010).</li></ol>

Regional-und zeitlich-spezifische Gen-Ablation über stereotaktischen Mikroinjektion von viralen Vektoren mit CPP kombiniert das Aussterben und Wiedereinstellung Phasen beinhaltet ermöglicht die Untersuchung der spezifischen Beiträge von Genen zu drei verschiedene Phasen der Sucht-Verhalten. Während konditionellen Knockout, die erreicht werden, indem die traditionelle Cre-loxP-System sorgt für räumlich-zeitlich beschränkt Genablation, stereotaxically Mikroinjizieren Cre-Rekombinase in diskrete Hirnareale von floxe...

Kokain ist eine stark verstärkende Psychostimulanzien. Nach wiederholter Exposition auftreten mehreren molekularen und zellulären Anpassungen in Lohn-relevante Schaltkreise im Gehirn, die glaubten, in zwanghaften führen, sind Drogen-sucht Verhalten, woraufhin hohen Rückfall, die eine schwerwiegende klinische Problem 1 darstellen. Kokain übt diese langanhaltende Auswirkungen auf das Verhalten von der Regulation der Genexpression. Um die Anpassungen, die an chronischer Kokainkonsum entstehen studieren, haben präklinischen Tiermodellen wurde intensiv genutzt. Ein solches Modell ist das konditionierte Platzpräferenz (CPP) Paradigma. Dieses Modell beinhaltet die Entwicklung eines gelernt Assoziation zwischen einer zuvor neutralen Umgebung und der lohnenden Eigenschaften von Kokain. Nach mehreren Paarungen von Kokain mit einer bestimmten Kammer werden Tiere frei erkunden die Kokain-gepaarten und nicht-Kokain-gepaarten Umgebungen und wenn sie die Droge-gepaarten Fach lieber, man sagt, sie erwarb eine Kokain-induzierte Plac habene Vorlieben. Darüber hinaus ist nach einer vom Aussterben Einarbeitungszeit kann dieses Paradigma verwendet, um kontext-spezifischen Wiedereinsetzung von Kokain-seeking Verhalten zu studieren. Im Vergleich zu anderen Verhaltensmodelle der süchtig-ähnliches Verhalten, wie psychomotorische Sensibilisierung, die verwendet werden, um langfristige Kokain-induzierte Verhaltens-und molekulare Plastizität 2,3 und Selbstverwaltung (SA) zu studieren ist, das gedacht wird, genauer nachahmen süchtig -ähnliches Verhalten beim Menschen gefunden wird, ist die CPP Paradigma ein einfaches Verfahren, um Kokain kontextuellen Lernen 4 studieren. CPP-Protokolle lassen sich bequem erweitert werden, um Auslöschung und Wiedereinstellung Phasen umfassen, ähnlich wie SA, die für die Untersuchung der Mechanismen, die Gier nach Drogen und Rückfall 5-7 und von denen angenommen wird, um Aspekte von dem, was geschieht in der menschlichen rekapitulieren Drogen-sucht Verhalten und Drogen erlauben - und Cue-induzierten Rückfall 8-10. Ein Mechanismus zugrunde liegt, dass dieKokain-induzierte Verhaltensänderungen Plastizität, die charakteristisch für jede der verschiedenen Phasen von CPP, einschließlich Erwerb, Löschung und Wiedereinstellung ist, ist die Aktivierung eindeutige Signaturen der Genexpression in verschiedenen Hirnregionen. Um direkt zu testen, welche Gene in Lohn-relevanten Hirnregionen vermitteln Verhaltensänderungen Kokain-induzierte, ist es sinnvoll, in der Lage sein, sie zu manipulieren selektiv in einem regional-spezifische Art und Weise. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen ist, um rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV)-Vektoren, die express Cre-Rekombinase mit stereotaktischen Chirurgie, in verschiedene Hirnareale von Mäusen, die Zielgene von LoxP Websites (floxed Mäuse) flankiert microinject. Dieses Verfahren ermöglicht eine sehr genaue zeitliche und regionale Kontrolle darüber, wann und wo Gene abgetragen werden, in beiden Teilen und nicht teilende Neuronen, ohne eine Immunantwort 11-13. Dieser Grad der Kontrolle stellt einen wichtigen Vorteil gegenüber herkömmlichen Cre-loxP Technologie der Zucht floxed Mäuse wit Mäusen, die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines endogenen Gen-Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitpunkt und die Verteilung der Gen-Deletion kann mehr genau reguliert werden. Außerdem umgeht viralen Vektor-vermittelte Gen-Knockout Potenzial für Entwicklungsstörungen kompensatorische Effekte, die auftreten, mit traditionellen Ko-Strategien können. Neben Kokain CPP, die hier beschrieben wird, Mikroinjektion von rAAV-Cre in das Gehirn von Mäusen floxed, um die Rolle von spezifischen Genen kann zu Verhaltensstörungen ubiquitär Paradigmen, die einzelnen Phasen, einschließlich Selbstverwaltung und psychomotorische Sensibilisierung beinhalten angewendet werden zu beurteilen. Zum Beispiel hat unser Labor die rAAV-Cre-Technologie verwendet, um die Rolle von Ca v 1.2 L-Typ-Ca 2 +-Kanäle in Kokain psychomotorische Sensibilisierung 14 studieren. Insbesondere wurde rAAV-Cre in den Nucleus accumbens (NAC) von Mäusen, die mit dem Gen Ca v 1.2 floxed, Mikroinjektion zu zeigen, dass Ca v </sub&gt; 1.2 Handeln in dieser Region vermittelt die Expression Phase der psychomotorischen Sensibilisierung 14,15. Doch die rAAV-Cre-Strategie kann nicht verwendet werden, wenn Mäuse mit einem floxed Gen von Interesse nicht vorhanden sind, wie es unsere Erfahrung bei der Beurteilung der Rolle der Ca v 1.3 L-Typ-Ca 2 +-Kanäle in psychomotorische Sensibilisierung. Daher stellt eine Einschränkung bei der Verwendung rAAV-Cre selbst wenn bedingte Mäusen nicht für ein bestimmtes Gen von Interesse vorhanden sind. Allerdings rAAVs dass express siRNA Knockdown auf Zielgene verwendet werden können, wie wir es getan, um die Rolle von Ca v 1.3 Kanäle 14,15 untersuchen haben. Mikroinjizieren rAAV-Cre in diskrete Hirnregionen floxed Mäusen und dann testen sie in der CPP Paradigma ermöglicht Untersuchung der spezifischen Gene, die die verschiedenen Phasen der süchtig-ähnliches Verhalten und wo sie tätig sind, zu vermitteln. Verwenden Sie dieses Paradigmas ist in unserem Verständnis geholfen, wie wiederholte Kokain Verwaltung im Wesentlichen die br entführtains Lohn-Schaltung verursacht maladaptive Veränderungen in der molekularen Signalwege und Genexpression, dass zu den süchtigen Zustand 1,16,17 führen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioned place preference activity chambers</td>
			<td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA</td>
			<td>MED-CPP-MS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment system for mouse</td>
			<td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td>
			<td>model 900</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringes</td>
			<td>Hamilton Company, Reno, Nevada, USA</td>
			<td>7634-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV2-Cre-GFP</td>
			<td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td>
			<td>7016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV2-GFP</td>
			<td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td>
			<td>7004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic microinjection of viral vectors expressing cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference

Mikroinjizieren rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV) Vektoren, die Cre-Rekombinase in verschiedene Maus Hirnregionen gezielt Knockout Gene von Interesse ermöglicht verbesserte zeitlich und regional-spezifische Kontrolle der Gen-Deletion, im Vergleich zu bestehenden Methoden. Während bedingte Löschung kann auch durch Kreuzen Mäusen erreicht werden, dass express Cre-Rekombinase unter der Kontrolle von spezifischen Gen-Promotoren mit Mäusen, die ein floxed Gen stereotaktischen Mikroinjektion zum Targeting von diskreten Hirnarealen bei Experimentator festgelegten Zeitpunkten von Interesse ermöglicht. Im Zusammenhang mit der Kokain klimatisierten Platzpräferenz und andere Kokain Verhaltensparadigmen wie Selbstverwaltung oder psychomotorische Sensibilisierung das kann Rücktritt, Aussterben und / oder Wiedereinstellung Phasen beinhalten, ist diese Technik besonders nützlich in der Erforschung der einzigartigen Beitrag der Zielgene zu diesen unterschiedlichen Phasen der Verhaltensmodelle von Kokain-induzierte Plastizität. InsbesondereDiese Technik ermöglicht die selektive Ablation von Zielgenen in diskreten Phasen des Verhaltens zu ihrem Beitrag zu dem Verhalten in der Zeit zu testen. Letztlich ermöglicht dieses Verständnis für eine gezieltere Therapie, die am besten in der Lage, die stärksten Risikofaktoren, die sich präsentieren in jeder Phase der Suchtverhalten anzusprechen sind.

CPP Nach Durchführung CPP auf mikroinjizierten Mäuse, sollte man sicherstellen, dass die Kohorte der Kontrolle injizierten (rAAV-GFP) Mäusen haben normalerweise Präferenz für die Droge-gepaart Kammer (1A, 1B) erworben. Mäuse werden als erworben Präferenz für eine bestimmte Kammer haben, wenn Kokain Vorlieben (Zeit in der Kokain-gepaarten Kammer minus Zeit in der Saline-Zweikammer aufgewendet) ist deutlich höher im Vergleich zum Ausgangswert Vorlieben der Gäste <strong...

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Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Dieser Artikel beschreibt, wie man virale Vektoren in Mäusegehirn microinject und dann in einem konditionierten Platzpräferenz Paradigma, das eine Akquisition, Aussterben und Wiedereinstellung Phase umfasst testen.

Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Forschung

Verhalten

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

Eine Vorgehensweise, um die Wirkung von Längerer Essen Beschränkung Heroin suche in abstinent Ratten untersucht

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

Fat Preference: A Novel Model of Eating Behavior in Rats

Fat Vorlieben: A Novel Modell des Essverhaltens bei Ratten

Obesity is a growing problem in the United States of America, with more than a third of the population classified as obese. One factor contributing to ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Eine Vorgehensweise, um Context-induzierte Erneuerung der Pawlowschen Anlage Alkoholsucht bei Ratten Verhalten beobachten

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Assessment of Cocaine-induced Behavioral Sensitization and Conditioned Place Preference in Mice

Bewertung der Kokain-induzierte Behavioral Sensibilisierung und konditionierten Platzpräferenz bei Mäusen

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to ...

Place and Response Learning in the Open-field Tower Maze

Zeigen and Response Learning in der Open-field-Turm Maze

This protocol describes how the Open-field Tower Maze (OFTM) paradigm is used to study spatial learning in rodents. This maze is especially useful for ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Pavlovian Trainings konditionierten Ansatz bei Ratten

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm

Wiedereinführung der Drug-seeking bei Mäusen mit dem klimatisierten Ort Präferenz Paradigma

The present protocol describes the Conditioned Place Preference (CPP) as a model of relapse in drug addiction. In this model, animals are first trained to ...

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

Eine konditionierte Ort Präferenz Protokoll zur Messung der Inkubation des Verlangens bei Ratten

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...