Name: stereotaxic microinjection of viral vectors expressing cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference
Uploaded: 2013-07-30T12:00:00
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Los autores desean agradecer a Anni Lee y Maureen Byrne por su ayuda en el establecimiento del protocolo de preferencia un lugar acondicionado extendida.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con el Weill Cornell Medical College Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión reglas. 1. Preparación y configuración de la administración estereotáxica de vectores virales <ol><li> Si un instrumento, hisopo estéril, o la mano usando guantes estériles están contaminados por el contacto con una superficie no estéril, deseche o volver a esterilizar el instrumento con un esterilizador de cuentas caliente, deseche el ...

<ol>
	<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+neurobiology+of+addiction.">Molecular neurobiology of addiction.</a> American Journal on Addictions. 10 (3), (2001).</li><li>Thomas, M. J., Kalivas, P. W., Shaham, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroplasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system+and+cocaine+addiction.">Neuroplasticity in the mesolimbic dopamine system and cocaine addiction.</a> British Journal of Pharmacology. 154 (2), (2008).</li><li>Robinson, T. E., Browman, K. E., Crombag, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine-induced+conditioned+place+preference+in+mice:+Induction,+extinction+and+reinstatement+by+related+psychostimulants.">Cocaine-induced conditioned place preference in mice: Induction, extinction and reinstatement by related psychostimulants.</a> Neuropsychopharmacology. 26 (1), (2002).</li><li>Kreibich, A. S., Blendy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+response+element-binding+protein+is+required+for+stress+but+not+cocaine-induced+reinstatement.">cAMP response element-binding protein is required for stress but not cocaine-induced reinstatement.</a> Journal of Neuroscience. 24 (30), (2004).</li><li>Obrien, C. P., Childress, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(v)1.2+L-Type+Ca2++Channels+Mediate+Cocaine-Induced+GluA1+Trafficking+in+the+Nucleus+Accumbens,+a+Long-Term+Adaptation+Dependent+on+Ventral+Tegmental+Area+Ca(v)1.3+Channels.">Ca(v)1.2 L-Type Ca2+ Channels Mediate Cocaine-Induced GluA1 Trafficking in the Nucleus Accumbens, a Long-Term Adaptation Dependent on Ventral Tegmental Area Ca(v)1.3 Channels.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), (2011).</li><li>Schierberl, K., Giordano, T., Satpute, S., Hao, J., Kaur, G., Hofmann, F., Moosmang, S., Striessnig, J., Rajadhyaksha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(v)1.3+L-type+Ca2++channels+mediate+long-term+adaptation+in+dopamine+D2L-mediated+GluA1+trafficking+in+the+dorsal+striatum+following+cocaine+exposure.">Ca(v)1.3 L-type Ca2+ channels mediate long-term adaptation in dopamine D2L-mediated GluA1 trafficking in the dorsal striatum following cocaine exposure.</a> Channels. 6 (1), 11-17 (2012).</li><li>Nestler, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+elimination+of+cacna1c+mediates+anxiety-like+behavior+in+mice.">Forebrain elimination of cacna1c mediates anxiety-like behavior in mice.</a> Molecular Psychiatry. 17 (11), (2012).</li><li>Li, X., Wolf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+virus-infected+brain+regions+using+a+GFP-illuminating+flashlight+enables+accurate+and+rapid+dissection+for+biochemical+analysis.">Visualization of virus-infected brain regions using a GFP-illuminating flashlight enables accurate and rapid dissection for biochemical analysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201 (1), 177-179 (2011).</li><li>Ahmed, B. Y., Chakravarthy, S., Eggers, R., Hermens, W., Zhang, J. Y., Niclou, S. P., Levelt, C., Sablitzky, F., Anderson, P. N., Lieberman, A. R., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+Cre-recombinase+to+neurons+in+vivo+and+stable+transduction+of+neurons+using+adeno-associated+and+lentiviral+vectors+-+art.+no.+5.">Efficient delivery of Cre-recombinase to neurons in vivo and stable transduction of neurons using adeno-associated and lentiviral vectors - art. no. 5.</a> BMC Neuroscience. 5, (2004).</li><li>Kaspar, B. K., Vissel, B., Bengoechea, T., Crone, S., Randolph-Moore, L., Muller, R., Brandon, E. P., Schaffer, D., Verma, I. M., Lee, K. F., Heinemann, S. F., Gage, F. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-cytotoxic+herpes+simplex+virus+vector+which+expresses+Cre+recombinase+directs+efficient+site+specific+recombination.">A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination.</a> Virus Research. 65 (1), (1999).</li><li>Choi, V. W., McCarty, D. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+hybrid+serotypes:+Improved+vectors+for+gene+delivery.">AAV hybrid serotypes: Improved vectors for gene delivery.</a> Current Gene Therapy. 5 (3), (2005).</li><li>Passini, M. A., Dodge, J. C., Bu, J., Yang, W., Zhao, Q., Sondhi, D., Hackett, N. R., Kaminsky, S. M., Mao, Q. W., Shihabuddin, L. S., Cheng, S. H., Sleat, D. E., Stewart, G. R., Davidson, B. L., Lobel, P., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+delivery+of+CLN2+reduces+brain+pathology+in+a+mouse+model+of+classical+late+infantile+neuronal+ceroid+lipofuscinosis.">Intracranial delivery of CLN2 reduces brain pathology in a mouse model of classical late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), (2006).</li><li>Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+stocks+of+recombinant+adeno-associated+viruses+-+normal+integration+does+not+require+viral+gene-expression.">Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses - normal integration does not require viral gene-expression.</a> Journal of Virology. 63 (9), (1989).</li><li>Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., Omalley, K. L., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene-expression+and+phenotypic+correction+using+adenoassociated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene-expression and phenotypic correction using adenoassociated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), (1994).</li><li>Johansen, J. P., Hamanaka, H., Monfils, M. H., Behnia, R., Deisseroth, K., Blair, H. T., LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+activation+of+lateral+amygdala+pyramidal+cells+instructs+associative+fear+learning.">Optical activation of lateral amygdala pyramidal cells instructs associative fear learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (28), (2010).</li><li>Zhang, F., Gradinaru, V., Adamantidis, A. R., Durand, R., Airan, R. D., de Lecea, L., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits:+technology+for+probing+mammalian+brain+structures.">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), (2010).</li></ol>

Regional-y la ablación génica temporal específica mediante microinyección estereotáxica de vectores virales combinadas con CPP, que incluye las fases de extinción y reintegro posibilite la investigación de las contribuciones específicas de genes en tres fases distintas de comportamiento adictivo similar. Mientras knockout condicional que se logra utilizando el sistema Cre-loxP tradicional prevé espacio-temporalmente la ablación génica restringidos, estereotáxicamente microinyección Cre-recombinasa en áreas...

La cocaína es un psicoestimulante altamente de refuerzo. Después de la exposición repetida, varias adaptaciones moleculares y celulares que ocurren en la recompensa correspondiente circuitos del cerebro que se cree que resulta en compulsiva búsqueda de drogas, lo que provocó altas tasas de recaída que representan un grave problema clínico 1. La cocaína ejerce estos efectos en el comportamiento de larga duración mediante la regulación de la expresión génica. Para estudiar las adaptaciones que surgen del uso crónico de la cocaína, modelos de roedores preclínicos se han utilizado ampliamente. Uno de estos modelos es el lugar de preferencia paradigma condicionado (CPP). Este modelo implica el desarrollo de una asociación entre un medio ambiente aprendido previamente neutro y las propiedades de recompensa de la cocaína. Después de varias parejas de cocaína con una cámara en particular, los animales se les permite explorar libremente los entornos de cocaína apareadas y no apareadas cocaína y si prefieren el compartimiento de las drogas de pares, que se dice que han adquirido una plac inducida por cocaínapreferencia de correo. Por otra parte, después de un período de entrenamiento de extinción, este paradigma se puede utilizar para estudiar el restablecimiento contexto específico de la cocaína de la conducta de búsqueda. En comparación con otros modelos de comportamiento de comportamiento adictivo-como, tales como la sensibilización psicomotora, que se utiliza para estudiar a largo plazo inducida por la cocaína y la plasticidad de comportamiento molecular de 2,3 y la auto-administración (SA), que se cree que con más precisión imitan adictivo un comportamiento similar se encuentra en los seres humanos, el paradigma CPP es un procedimiento simple para estudiar la cocaína aprendizaje contextual 4. Protocolos de CPP pueden ser convenientemente ampliarse para incluir la extinción y fases de reintegro, al igual que SA, que permiten la investigación de los mecanismos que subyacen ansia por la droga y la recaída 5-7 y que se cree que recapitular los aspectos de lo que ocurre en el hombre la búsqueda de drogas y el narcotráfico - y cue-inducida recaída 8-10. Un mecanismo que subyace a lainducido por cocaína plasticidad de comportamiento que es característico de cada una de las distintas fases de la CPP, incluyendo la adquisición, la extinción, y el restablecimiento, es la activación de firmas únicas de la expresión de genes dentro de las diferentes regiones del cerebro. Para probar directamente que los genes dentro de las regiones cerebrales relevantes para mediar recompensa inducido por cocaína cambios de comportamiento, es útil ser capaz de manipular de forma selectiva de una manera regionalmente específica. Una forma de lograr esto es a microinject recombinantes vectores virales adenoasociados (rAAV) que expresan la recombinasa Cre utilizando la cirugía estereotáxica, en distintas áreas del cerebro de ratones que tienen genes diana flanqueado por sitios LoxP (ratones floxed). Este método permite un control temporal y regional muy preciso sobre el momento y donde los genes se realiza la ablación, tanto en neuronas que dividen y que no se dividen, sin inducir respuestas inmunes 11-13. Este nivel de control representa una importante ventaja sobre la tecnología tradicional Cre-loxP de criar ratones floxed with ratones que expresan la recombinasa Cre bajo el control de un promotor de gen endógeno, en el que el tiempo y distribución de supresión de genes pueden ser reguladas con más fuerza. Además, viral génica mediada por vectores evita posibles efectos compensatorios de desarrollo que pueden producirse utilizando estrategias knockout tradicionales. En adición a la cocaína CPP, que se describe aquí, la microinyección de rAAV-Cre en el cerebro de los ratones floxed para evaluar el papel de los genes específicos se puede aplicar ubicua a paradigmas de comportamiento que implican fases separadas, incluyendo la auto-administración y la sensibilización psicomotora. Por ejemplo, nuestro laboratorio ha utilizado la tecnología de rAAV-Cre para estudiar el papel de Ca v 1.2 2 canales tipo L de Ca + en cocaína sensibilización psicomotora 14. Específicamente, rAAV-Cre se microinyectó en el núcleo accumbens (NAc) de ratones con el gen que codifica Ca v 1.2 floxed, para demostrar que el Ca v </sub&gt; 1,2 actuando en esta región interviene en la fase de expresión de la sensibilización psicomotora 14,15. Sin embargo, la estrategia de rAAV-Cre no se puede utilizar si no existen ratones con un gen floxed de interés, como fue nuestra experiencia cuando la evaluación de la función de Ca v 1.3 2 canales de tipo L Ca + en la sensibilización psicomotora. Por lo tanto, una limitación de la utilización de rAAV-Cre se presenta si los ratones condicionales no existen para un gen particular de interés. Sin embargo, rAAVs que expresan siRNA se puede utilizar para los genes diana desmontables, como lo hemos hecho para examinar el papel de Ca v 1.3 canales 14,15. Microinyección de rAAV-Cre en regiones discretas del cerebro de ratones floxed y luego ponerlos a prueba en el paradigma de la CPP permite la investigación de los genes específicos que median en las diversas fases de comportamiento adictivo-como y donde están actuando. El uso de este paradigma ha ayudado en nuestra comprensión de cómo la administración repetida de cocaína, en esencia, secuestra el brains circuito de recompensa causando cambios inadaptadas en las vías de transducción de señales moleculares y la expresión génica que conducen al estado de adicción 1,16,17.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioned place preference activity chambers</td>
			<td>Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA</td>
			<td>MED-CPP-MS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment system for mouse</td>
			<td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td>
			<td>model 900</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringes</td>
			<td>Hamilton Company, Reno, Nevada, USA</td>
			<td>7634-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV2-Cre-GFP</td>
			<td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td>
			<td>7016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV2-GFP</td>
			<td>Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA</td>
			<td>7004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic microinjection of viral vectors expressing cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference

Microinyección recombinante vectores virales adenoasociados (rAAV) que expresan la recombinasa Cre en distintas regiones del cerebro del ratón se convierte selectivamente genes knockout de interés permite un mejor control temporal y regionalmente específica de supresión de genes, en comparación con los métodos existentes. Mientras que la supresión condicional también se puede lograr por los ratones de apareamiento que expresan la recombinasa Cre bajo el control de promotores de genes específicos con ratones que portan un gen floxed, microinyección estereotáxica permite la selección de las zonas discretas del cerebro en puntos de tiempo experimentador-determinadas de interés. En el contexto de la cocaína lugar acondicionado preferencia, y otros paradigmas de comportamiento cocaína tales como la auto-administración o sensibilización psicomotora que puede implicar la retirada, extinción y / o fases de reinstalación, esta técnica es particularmente útil en la exploración de la contribución única de los genes diana a estos distintos fases de los modelos de comportamiento de plasticidad inducida por la cocaína. Específicamente,esta técnica permite la ablación selectiva de los genes diana durante las fases discretas de un comportamiento a prueba su contribución al comportamiento a través del tiempo. En última instancia, este conocimiento permite terapias más específicas que están en mejores condiciones para hacer frente a los factores de riesgo más potentes que se presentan durante cada fase de la conducta adictiva.

CPP Después de realizar CPP en ratones microinyectados, se debe verificar que la cohorte de control de inyección de (rAAV-GFP) ratones han adquirido normalmente preferencia por la cámara de drogas emparejado (Figura 1A, 1B). Los ratones se considera que han adquirido preferencia por una cámara en particular cuando preferencia cocaína (tiempo de permanencia en la cámara de la cocaína de pares de menos tiempo de permanencia en la cámara de solución salina-emparejado) es ...

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Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

En este artículo se describe cómo microinject vectores virales en el cerebro del ratón y luego probar en un paradigma de preferencia un lugar acondicionado que incluye una fase de adquisición, extinción y reintegro.

La microinyección estereotáxica de vectores virales que expresan Cre recombinasa para estudiar el papel de los genes diana de cocaína acondicionado Place Preferencia

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

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Investigación

Comportamiento

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