Name: simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion at JoVE.com

De auteurs willen dr. Douglas Goetz (afdeling Chemische en Biomoleculaire Engineering, Ohio University) en dr. Fabian Benencia (Departement Biomedische Wetenschappen, Universiteit van Ohio) bedanken voor inzichtelijke discussies en manuscript beoordeling. We danken ook Dr Christopher Huppenbauer voor nuttige technische discussies (W. Nuhsbaum Inc). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Foundation (CBET-1106118) en de National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

1. Software-installatie <ol><li> Kopen StreamPix 5 Multi-Camera-software met SimulPix module of andere beeldbewerkingssoftware kan verzamelen en combineren van beelden die door monochrome CCD camera&#39;s. </li><li> Minimumeisen voor StreamPix 5 zijn: Een PC uitgerust met een Core 2 Duo 2,4 GHz of beter met 2 GB RAM of hoger. Een ondersteunde IEEE digitale of analoge camera en compatibel frame grabber. Windows XP/7/Vista 32 of 64 bit. Een monitor met resolutie 1024 x 768 of hoger. Een grafische adapter met goede 2D-pr...

<ol>
	<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).</li><li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=carcinoma+cell+glycolipids,+integrins,+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow.">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li><li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions.">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li><li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands.">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li><li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion:+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces.">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li><li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow:+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion.">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li><li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions.">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li><li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells:+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways?.">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?.</a> Front. Oncol. 2, 103 (2012).</li><li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Importance+of+Titrating+Antibodies+for+Immunocytochemical+Methods.">The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2001).</li><li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells.">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li><li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules.">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li><li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development.">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li><li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system:+a+custom+technology+platform+for+high-speed,+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses.">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li><li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions.">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li><li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

De dubbele camera emissie splitsysteem heeft de ruimte, tijd, en optische resolutie die nodig is om hoge kwaliteit beelden vast te leggen in toepassingen waar cel of moleculaire beweging is snel. Bij het genereren van de representatieve resultaten, parameters in de dubbele camera emissie splitsysteem, waaronder software-instellingen en camera-instellingen, werden geoptimaliseerd om een ​​samengevoegde afbeelding volgorde waarin rollen en hechtende cellen waren ruimte en tijd uitgelijnd verkrijgen. Deze optimalisatie...

Werkwijzen voor de analyse van moleculen op het celoppervlak, zoals immunokleuring, gebruiken probes die chemisch geconjugeerd aan fluoroforen, waardoor detectie van doelmoleculen. Live cell imaging en hydrodynamische flow-based cel adhesie testen worden meestal opgenomen met monochrome CCD-camera&#39;s ontworpen om fysiologische processen vast te leggen op de cellulaire en / of moleculair niveau 1, 2. Deze camera&#39;s zijn zeer gevoelig, leveren snel frame rates (meer dan 30 frames per seconde), en bieden buitengewone temporele resolutie (als gevolg van een hoge beeldsnelheid en korte belichtingstijden). Echter, monochrome camera&#39;s slechts een enkele emissie kanaal (het detecteren van een enkele fluorofoor) om beelden te verzamelen vastleggen. Een camera emissie splitsen systemen kunnen worden opgenomen om meerdere kanalen emissie vangen maar vaak verminderen het gezichtsveld en vereisen dezelfde belichtingstijd voor beeldvorming alle kanalen. Om het volledige kleurenspectrum van cellen gelabeld met multip vastleggenle fluoroforen, een kleurencamera worden gebruikt als alternatief. Echter, kleurencamera&#39;s in het algemeen niet in staat om het gewenste temporele resolutie voor beeldvorming van levende cellen in bepaalde toepassingen. Een andere afbeeldingsinrichting is nodig voor toepassingen waarbij het de voorkeur beeld levende cellen bij verschillende golflengten met behoud van een hoge tijdsresolutie. Een van de belangrijkste experimentele toepassing is de parallelle plaat stroom kamer adhesieanalyse, waarbij cellen worden doorbloed bij fysiologisch relevante omstandigheden over een mogelijk reactieve substraat 1, 3. Cellen in flow die specifieke celoppervlak-moleculen tot expressie kunnen hechten en rollen op het substraat, zoals een cel monolaag expressie adhesiemoleculen of-oppervlak geadsorbeerd extracellulaire matrixeiwitten 4, 5. Rolling cellen kunnen rotatie en translatie ondergaan in een fractie van een seconde. Moleculaire functies op rollen en hechtende cellen, zoals clusters van celoppervlak moleculen, ook de potentiometeral actief reorganiseren op het celoppervlak. Zo moet beeldvormingssystemen uitzonderlijk temporele resolutie bieden (30 frames per seconde of meer en &quot;bijna nul&quot; blootstellingstijden) aan een sequentie van beelden die de stap-voor-stap progressie van cellen rollen 6, 7 illustreert genereren. Dubbele camera emissie splitsing systemen zijn in staat om aan deze eisen voor de beeldvorming van cellen gelabeld met meerdere fluoroforen. Dual camera emissie splitsen systemen splitsen en filter fluorescentie kanalen in twee soortgelijke camera&#39;s tegelijk vastleggen twee ruimtelijk identieke maar fluorofoor-specifieke beelden met behoud van de volledige gezichtsveld. Deze technologie maakt een directe vergelijking van de opname in real-time in elk kanaal en kan de gebruiker snel schakelen tussen camera modellen met verschillende imaging-mogelijkheden. Deze functie is handig voor het maken van aanpassingen aan het vastleggen van instellingen in een camera die beter kan het systeem om vast te leggenfluoroforen met verschillende intensiteiten, levens, en extinctiecoëfficiënten 8. In combinatie met imaging software, dubbele camera emissie splitsen systemen maken het real-time opname van live cell imaging assays in meerdere golflengten en kan in vitro testen die fluorescentie gebruikt om mobiele gedrag te bestuderen verbeteren.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Multi-color immunofluorescentie microscopie specifieke moleculen te detecteren in de celmembraan kan worden gekoppeld met parallelle plaat stroming kamer assays mechanismen die celhechting onder dynamische stroomomstandigheden te onderzoeken. Zo kunnen kankercellen waarop meerdere fluoroforen worden doorbloed over een mogelijk reactieve substraat mechanismen van kanker metastase model. Echter, multi-kanaals enkele camerasystemen en kleurencamera&#39;s tekortkomingen vertonen in beeldopname voor real-time live cell analyse. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we gebruik gemaakt van een dubbele camera uitstoot splitsing systemen tegelijkertijd vangen real-time beeld sequenties van fluorescent gelabelde cellen in de stroom kamer. Dubbele camera emissie splitsen systemen filter gedefinieerde golflengte varieert in twee monochrome CCD-camera&#39;s, waardoor gelijktijdig vastleggen van twee ruimtelijk identiek, maar fluorophore-specifieke beelden. Vervolgens worden psuedocolored eenkanaals beelden gecombineerd in eenreal-time fusie sequentie die meerdere doelmoleculen kunnen onthullen op cellen snel bewegen over een van belang.

Een parallelle plaat stroom kamer adhesieanalyse werd gebruikt om een dubbele camera emissie splitsysteem die gelijktijdig gevangen real-time beeld-sequenties in twee emissie-kanalen (figuur 1) te tonen. De dubbele camera emissie splitsysteem gedetecteerd BT-20 cellen die fluorescent werden gemerkt met anti-humaan CD24 en HECA-452 (detectie sialofucosylated antigenen) monoklonale antilichamen en geschikte secundaire antilichamen (Figuur 2). Sommige rollen cellen weergegeven rode signale...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion at JoVE.com

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Gelijktijdig vastleggen van real-time beelden in Two Emissie Kanalen Met een Dual Camera Emission Splitting Systeem: Toepassingen op Hechting Cell

Dubbele camera emissie splitsen systemen voor twee-kleuren fluorescentie microscopie genereren real-time beeld sequenties met een uitzonderlijke optische en temporele resolutie, een eis van bepaalde levende cel proeven, waaronder parallelle plaat stroom kamer adhesietesten. Wanneer de software wordt gebruikt om beelden van simultane emissie kanalen samenvoegt, worden pseudocolored beeldsequenties geproduceerd.

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real-time monitoring van de intracellulaire Bile Acid Dynamics Met behulp van een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Hand-held klinische Photoacoustic Imaging systeem voor Real-time niet-invasieve kleine dierlijke Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Twee methoden voor Decellularization van plantaardige weefsels voor Tissue Engineering toepassingen

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Microscopie voor real-time bepaling van eencellige morfologie in bioprocessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...