Name: simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00
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Die Autoren danken Dr. Douglas Goetz (Institut für Chemische und Biomolekulare Ingenieurwissenschaften, Ohio University) und Dr. Fabian Benencia (Department of Biomedical Sciences, Ohio University) für aufschlussreiche Diskussionen und Kritik Manuskript danken. Wir danken auch Dr. Christopher Huppenbauer für hilfreiche technische Diskussionen (W. Nuhsbaum Inc.). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der National Science Foundation (CBET-1106118) und der National Institutes of Health (1R15CA161830-01) unterstützt.

1. Software-Installation <ol><li> Kaufen StreamPix 5 Multi-Kamera-Software mit SimulPix Modul oder andere Imaging-Software in der Lage, das Sammeln und Kombinieren von Bildern durch monochrome CCD-Kameras eingefangen. </li><li> Mindestanforderungen für StreamPix 5 sind: Ein PC mit Core 2 Duo ausgestattet mit 2,4 GHz oder besser mit 2 GB RAM oder höher. Ein unterstützter IEEE digitale oder analoge Kamera und kompatible Framegrabber. Windows-XP/7/Vista 32 oder 64 Bit. Ein Monitor mit Auflösung 1024 x 768 oder höher...

<ol>
	<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).</li><li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. 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Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem hat die räumliche, zeitliche und optische Auflösung benötigt, um qualitativ hochwertige Bilder in Anwendungen, bei denen Zell-oder Molekularbewegung schnell ist zu erfassen. Bei der Erzeugung der repräsentative Ergebnisse, Parameter in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, einschließlich Software-Einstellungen und Kameraeinstellungen wurden optimiert, um eine zusammengeführte Bildfolge, in der Walz-und adhärenten Zellen waren zeitlich und räumlich ausgerichtet zu erhalten. Di...

Verfahren zur Analyse von Molekülen auf der Zelloberfläche, wie z. B. Immunfärbung Sonden einzusetzen, die chemisch mit Fluorophoren konjugiert sind, was den Nachweis von Zielmolekülen. Live-Cell-Imaging-und hydrodynamischen Fluss-basierte Zelladhäsionsassays werden typischerweise mit monochromen CCD-Kameras entwickelt, um physiologische Prozesse auf zellulärer und / oder molekularer Ebene 1, 2 erfassen aufgezeichnet. Diese Kameras sind sehr empfindlich, liefern schnelle Bildraten (mehr als 30 Bilder pro Sekunde) und bieten außergewöhnliche zeitliche Auflösung (durch schnelle Bildraten und kurzen Belichtungszeiten). Allerdings kann nur Monochrom-Kameras erfassen einen einzigen Emissionskanal (Erfassung eines einzelnen Fluorophors), um Bilder zu sammeln. Einzelne Kamera Emissions Splitting-Systeme können integriert werden, um mehrere Emissionskanäle zu erfassen, aber oft reduzieren das Sichtfeld und benötigen die gleiche Belichtungszeit für die Abbildung aller Kanäle. Um das volle Farbspektrum von Zellen mit multip beschriftet erfassenle Fluorophore, eine Farbkamera kann als Alternative verwendet werden. Allerdings sind Farbkameras in der Regel nicht in der Lage, die für Live-Cell-Imaging in bestimmten Anwendungen gewünschten zeitlichen Auflösung. Eine weitere bildgebende Gerät ist für Anwendungen, bei denen es vorteilhaft ist, Bild lebenden Zellen bei mehreren Wellenlängen ist, unter Beibehaltung einer hohen zeitlichen Auflösung benötigt. Ein Hauptanwendungsgebiet ist die experimentelle Parallelplattenflusskammer Adhäsionstest, in denen Zellen in physiologisch relevanten Bedingungen über einen potentiell reaktive Substrat 1, 3 perfundiert. Zellen, die in Strömungs spezifische Zelloberflächenmoleküle exprimieren, haften und rollen auf dem Substrat, beispielsweise eine Zell-Monoschicht exprimieren Adhäsionsmoleküle oder Oberfläche adsorbiert extrazelluläre Matrixproteine, 4, 5. Rollzellen können Rotations-und Translationsbewegung in Bruchteilen einer Sekunde durchlaufen. Molekularen Eigenschaften auf Walzen und adhärente Zellen, wie Cluster von Zelloberflächenmolekülen, auch die Potentiometeral aktive Reorganisation auf der Zelloberfläche zu unterziehen. Somit muß Abbildungssysteme eine außergewöhnliche zeitliche Auflösung liefern (30 Frames pro Sekunde oder mehr und &quot;nahe Null&quot; Belichtungszeiten), um eine Bildfolge, die die Schritt-für-Schritt-Fortschreiten der Zelle Walzen 6, 7 veranschaulicht zu erzeugen. Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme sind in der Lage, diese Anforderungen zu erfüllen für die Bildgebung von Zellen mit mehreren Fluorophoren markiert. Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme aufgeteilt und Filterfluoreszenzkanäle in zwei ähnliche Kameras erfassen gleichzeitig zwei räumlich identisch, aber Fluorophor spezifische Bilder unter Beibehaltung der vollen Sichtfeld. Diese Technologie ermöglicht den direkten Vergleich der in Echtzeit in jedem Kanal aufgenommene Bild und ermöglicht dem Benutzer, schnell zwischen Kamera-Modelle wechseln mit verschiedenen Imaging-Funktionen. Diese Funktion ist nützlich, um Einstellungen für Bild-Capture-Einstellungen in eine Kamera, die besser damit das System zu erfassenFluorophore mit unterschiedlichen Intensitäten, Gültigkeitsdauer und Extinktionskoeffizienten 8. Gekoppelt mit Imaging-Software, Dual-Kamera-Emissionsspalt Systeme ermöglichen die Echtzeit-Aufzeichnung von Live-Cell-Imaging-Tests in mehreren Wellenlängen und kann in vitro-Assays, die Fluoreszenz zu verwenden, um das Verhalten der Zelle untersuchen zu verbessern.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Multi-Color-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, um bestimmte Moleküle in der Zellmembran erkennen kann, mit Parallelplattenlaufkammer Assays zu Mechanismen, die Zell-Adhäsion unter dynamischen Strömungsbedingungen zu untersuchen gekoppelt werden. Beispielsweise können Krebszellen mit mehreren Fluorophoren über eine möglicherweise reaktive Substrat zu modellieren Mechanismen der Krebsmetastasierung perfundiert werden. Allerdings, Multi-Channel einzelnen Kamera-Systeme und Farbkameras zeigen Mängel in der Bildaufnahme für die Echtzeit-Live-Zellanalyse. Um diese Einschränkungen zu überwinden, eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem verwendeten wir gleichzeitig erfassen Echtzeit-Bildsequenzen von fluoreszenzmarkierten Zellen in der Flusskammer. Dual-Kamera-Systeme Emissionsspaltfilter definierten Wellenlängenbereichen in zwei monochrome CCD-Kameras, wodurch gleichzeitig erfassen zwei räumlich identisch, aber Fluorophor-spezifische Bilder. Anschließend werden psuedocolored Ein-Kanal-Bilder in einer einzigen kombiniertenEchtzeit-Sequenz zusammengeführt, die mehrere Zielmoleküle auf Zellen, die sich schnell über einen Bereich von Interesse offenbaren kann.

Eine Parallelplattenlaufkammer Haftung Assay wurde verwendet, um eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, die gleichzeitig in zwei Emissionskanäle erfasst Echtzeit-Bildsequenzen (Abbildung 1) zu demonstrieren. Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem erkannt BT-20-Zellen, die mit Fluoreszenz-Anti-Human-CD24 und HECA-452 (Erkennung sialofucosylated Antigene) monoklonale Antikörper und entsprechenden Sekundärantikörper (Abbildung 2) markiert waren. Einige Roll Zellen angezeigt rote Signale ...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

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A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

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Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

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