Name: simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Douglas Goetz (Dipartimento di chimica e biomolecolare, Ohio University) e il Dr. Fabian Benencia (Dipartimento di Scienze Biomediche, Ohio University) per le discussioni penetranti e la revisione del manoscritto. Ringraziamo anche il Dott. Christopher Huppenbauer per utili discussioni tecniche (W. Nuhsbaum Inc.). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation (CBET-1.106.118) e il National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

1. Installazione del software <ol><li> Acquistare StreamPix 5 software Multi-Camera con modulo SimulPix o altri software di imaging in grado di raccogliere e combinare immagini catturate dalle telecamere in bianco e nero CCD. </li><li> Requisiti minimi per StreamPix 5 includono: Un PC dotato di processore Core 2 Duo a 2,4 GHz o superiore con 2 GB di RAM o superiore. Una fotocamera supportata IEEE digitale o analogico e frame grabber compatibile. XP/7/Vista di Windows a 32 o 64 bit. Un monitor con risoluzione 1.024 x 7...

<ol>
	<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).</li><li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=carcinoma+cell+glycolipids,+integrins,+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow.">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li><li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions.">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li><li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands.">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li><li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion:+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces.">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li><li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow:+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion.">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li><li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions.">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li><li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells:+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways?.">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?.</a> Front. Oncol. 2, 103 (2012).</li><li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Importance+of+Titrating+Antibodies+for+Immunocytochemical+Methods.">The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2001).</li><li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells.">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li><li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules.">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li><li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development.">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li><li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system:+a+custom+technology+platform+for+high-speed,+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses.">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li><li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions.">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li><li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

Il sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera ha la risoluzione spaziale, temporale e ottica necessarie a catturare immagini di alta qualità in applicazioni dove cella o movimento molecolare è rapido. Nel generare i risultati rappresentativi, parametri del sistema duale splitting emissione telecamera, incluse le impostazioni software e le impostazioni della fotocamera, sono stati ottimizzati per ottenere una sequenza immagine fusa in cui rotolamento e cellule aderenti sono spazialmente e temporalmente alli...

Metodi per l&#39;analisi di molecole sulla superficie cellulare, come immunostaining, impiegano sonde coniugate chimicamente per fluorofori, permettendo la rilevazione di molecole bersaglio. Cellule vive e saggi di adesione cellulare basati sul flusso idrodinamico sono tipicamente registrate con telecamere CCD monocromatico per catturare processi fisiologici a livello cellulare e / o molecolare 1, 2. Queste telecamere sono estremamente sensibili, consegnare frame rate veloci (superiori a 30 fotogrammi al secondo), e di fornire risoluzione temporale eccezionale (a causa di frame rate veloci e tempi di esposizione brevi). Tuttavia, le telecamere monocromatiche possono catturare solo un singolo canale di emissione (rilevare un singolo fluoroforo) per raccogliere immagini. Sistemi splitting emissione fotocamera singoli possono essere incorporati per catturare canali multipli emissione ma spesso riducono il campo visivo e richiedono lo stesso tempo di esposizione per l&#39;imaging tutti i canali. Per catturare lo spettro di colori da cellule marcate con multipLe fluorofori, una telecamera a colori può essere utilizzata come alternativa. Tuttavia, telecamere a colori non sono generalmente in grado di fornire la risoluzione temporale desiderato per l&#39;imaging cellulare dal vivo in alcune applicazioni. Un altro dispositivo di imaging è necessaria per applicazioni in cui è vantaggioso immagine cellule scena a più lunghezze d&#39;onda, pur mantenendo un&#39;elevata risoluzione temporale. Un&#39;applicazione sperimentale principale è la camera di flusso piastra di saggio adesione parallelo, in cui le cellule sono perfusi in condizioni fisiologicamente rilevanti sopra un substrato potenzialmente reattivi 1, 3. Le cellule in flusso che esprimono specifiche molecole della superficie cellulare possono aderire e rotolano sul substrato, come un monostrato di cellule che esprimono molecole di adesione o proteine ​​della matrice extracellulare-superficie adsorbito 4, 5. Celle di laminazione possono subire movimento di rotazione e traslazione in frazioni di secondo. Caratteristiche molecolari di rotolamento e cellule aderenti, ad esempio gruppi di molecole di superficie cellulare, hanno anche il potenziometroal di sottoporsi riorganizzazione attiva sulla superficie cellulare. Così, sistemi di imaging devono fornire una risoluzione temporale eccezionale (30 fotogrammi al secondo o superiore e &quot;vicino allo zero&quot; tempi di esposizione) per generare una sequenza di immagini che illustra la progressione passo-passo di cellula rotolamento 6, 7. Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera sono in grado di soddisfare queste esigenze di imaging di cellule marcate con più fluorofori. Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera divisi e canali del filtro di fluorescenza in due fotocamere simili per catturare simultaneamente due immagini identiche ma spazialmente specifico fluoroforo, pur mantenendo l&#39;intero campo visivo. Questa tecnologia consente il confronto diretto delle immagini catturate in tempo reale in ciascun canale e permette all&#39;utente di passare rapidamente tra i modelli di fotocamere con differenti capacità di imaging. Questa funzione è utile per effettuare regolazioni alle impostazioni di cattura immagine in una macchina fotografica che meglio consentono al sistema di catturarefluorofori con diverse intensità, durata e coefficienti di estinzione 8. Accoppiato con software di imaging, sistemi splitting emissione telecamere doppi permettono la registrazione in tempo reale di saggi imaging delle cellule vive a lunghezze d&#39;onda multiple e possono aumentare saggi in vitro che utilizzano fluorescenza per studiare il comportamento cellulare.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Multicolore immunofluorescenza microscopia per rilevare specifiche molecole nella membrana cellulare può essere accoppiato con saggi camera di flusso piastra paralleli a studiare i meccanismi che regolano l&#39;adesione cellulare in condizioni di flusso dinamico. Per esempio, le cellule tumorali marcate con fluorofori multipli possono essere perfusi sopra un substrato potenzialmente reattivi per modellare meccanismi di metastasi del cancro. Tuttavia, i sistemi un&#39;unica telecamera multi-canale e videocamere a colori presentano carenze in acquisizione delle immagini per analisi in tempo reale delle cellule vive. Per superare queste limitazioni, abbiamo utilizzato un sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera per catturare simultaneamente in tempo reale sequenze di immagini di cellule fluorescente nella camera di flusso. Lunghezza d&#39;onda del filtro sistemi di scissione delle emissioni doppia fotocamera definito spazia in due fotocamere CCD monocromatiche, così contemporaneamente catturare due immagini identiche ma spazialmente specifico fluoroforo. Successivamente, psuedocolored immagini una canali sono combinati in un unicoin tempo reale fusa sequenza che può rivelare più molecole bersaglio sulle cellule muoversi rapidamente in una regione di interesse.

Una camera di flusso piatto saggi di adesione parallelo è stato utilizzato per dimostrare un sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera che, contemporaneamente catturato sequenze di immagini in tempo reale in due canali di emissione (Figura 1). Il sistema di splittaggio emissione fotocamera dual rilevato BT-20 cellule che sono state fluorescente con anti-CD24 umano e HECA-452 (rilevamento di antigeni sialofucosylated) anticorpi monoclonali e anticorpi secondari appropriati (Figura 2...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Contemporaneamente Catturare immagini in tempo reale in due canali di emissione Utilizzando un Splitting sistema Dual Camera Emissione: Applications to Cell Adhesion

Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera per due colori microscopia a fluorescenza generano in tempo reale sequenze di immagini con risoluzione ottica e temporale eccezionale, un requisito di alcuni saggi cellulari in tempo reale tra cui saggi di adesione cella di flusso piastra paralleli. Quando il software viene utilizzato per unire le immagini provenienti dai canali di emissione acquistati contemporaneamente, sequenze di immagini pseudocolored sono prodotti.

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

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