Name: simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00
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著者は、洞察力に富んだ議論や論文審査のために博士ダグラス·ゲッツ（化学と生体分​​子工学専攻、オハイオ大学）博士ファビアンBenencia（医歯薬学総合研究科、オハイオ大学）に感謝したい。また、役立つ技術的な議論（W. Nuhsbaum社）博士クリストファーHuppenbauerに感謝します。この作品は、国立科学財団（CBET-1106118）と国立衛生研究所（1R15CA161830-01）からの補助金によって支えられている。

1。ソフトウェアのインストール<ol><li>購入StreamPix SimulPixモジュールまたはモノクロCCDカメラで撮影した画像を収集し、組み合わせることのできる他のイメージングソフトウェアを使用して5マルチカメラソフトウェア。 </li><li> StreamPix 5の最小要件は次のとおりです。2ギガバイト以上のRAMと2.4 GHz以上でのCore 2 Duoを搭載したパソコン。サポートIEEEデジタルまたはアナログのカメラと互換性の?...

<ol>
	<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).</li><li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=carcinoma+cell+glycolipids,+integrins,+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow.">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li><li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions.">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li><li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands.">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li><li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion:+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces.">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li><li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow:+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion.">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li><li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions.">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li><li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells:+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways?.">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?.</a> Front. Oncol. 2, 103 (2012).</li><li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Importance+of+Titrating+Antibodies+for+Immunocytochemical+Methods.">The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2001).</li><li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells.">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li><li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules.">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li><li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development.">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li><li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system:+a+custom+technology+platform+for+high-speed,+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses.">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li><li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions.">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li><li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

デュアルカメラ発光分割システムは、細胞または分子の動きが速い用途で高品質の画像をキャプチャするために必要な空間的、時間的、および光学的分解能を有する。代表的な結果を生成する際に、ソフトウェアの設定やカメラ設定を含むデュアルカメラ発光分割システム、のパラメータは、ローリングおよび接着細胞は、空間的および時間的に整列されたマージされた画像シーケンスを得?...

例えば、免疫染色、細胞表面上の分子の分析のための方法、化学的標的分子の検出を可能にする、フルオロフォアにコンジュゲートされたプローブを用いる。生細胞イメージングおよび流体力学的フローベースの細胞接着アッセイは、典型的には、細胞および/ ​​または分子レベル1、2で生理学的プロセスを捕捉するように設計されたモノクロCCDカメラで記録される。これらのカメラは、高速フレームレート（1秒あたりのより大きい30フレーム）を提供し、（原因速いフレームレートと短い露光時間に）非常に優れた時間分解能を提供する、非常に敏感である。しかし、モノクロカメラは、画像のみを収集するために（シングル蛍光体を検出する）、単一の放出チャネルをキャプチャすることができます。単一のカメラ発光分割システムは、複数の放射チャネルを捕捉するために組み込まれたが、多くの場合、視野を低減し、全チャンネルを画像化するために同じ露光時間を必要とすることができる。 multipで標識した細胞から完全なカラースペクトラムをキャプチャするにはルフルオロフォア、カラーカメラは、代替として使用することができる。しかしながら、カラーカメラは、一般に、特定の用途において生細胞イメージングのために所望の時間分解能を提供することができない。別の撮像装置は、高時間分解能を維持しながら、複数の波長で画像生細胞に有利である用途のために必要とされる。プライミング実験のアプリケーションは、細胞が潜在的に反応性の基板1,3の上に生理学的に関連する条件下で灌流された平行板フローチャンバー接着アッセイである。このような接着分子または表面に吸着細胞外マトリックスタンパク4,5を発現する細胞単層のような特定の細胞表面分子を発現する細胞をフロー内の基板上に付着し、ロールよい。ローリング細胞は、第二の画分に回転および並進運動を受けることができる。このような細胞表面分子のクラスターとしてローリングおよび接着細胞上の分子の機能も、ポテンショを有する細胞表面上で活性の再編成を受けるらこれにより、撮像システムは、6,7の圧延セルのステップバイステップの進行を示す画像シーケンスを生成するために、例外的な時間分解能（秒以上と露光時間「ゼロに近い」毎秒30フレーム）を提供しなければならない。デュアルカメラ発光分割システムは、複数のフルオロフォアで標識された細胞を画像化するためのこれらの要求を満たすことができる。 デュアルカメラ発光分割システムは、全視野を維持しながら、同時に2つの空間的に同一であるが、フルオロフォア固有の画像を捕捉するつの類似のカメラに蛍光チャネルを分割し、フィルタ。この技術は、各チャネルの実時間で撮像した画像の直接比較を可能にし、ユーザが迅速に異なる撮像機能を備えたカメラモデルの間で切り替えることができる。この特徴は、より良いシステムをキャプチャすることを可能にする1つのカメラで画像キャプチャ設定を調整する場合に有用である異なる強度、寿命、および吸光係数8と蛍光団。イメージングソフトウェアと相まって、二重カメラ放出分割システムは、複数の波長の生細胞イメージングアッセイのリアルタイム記録を可能にし、細胞の挙動を研究するために蛍光を使用するin vitroアッセイを高めることができる。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

細胞膜に特異的な分子を検出するための多色免疫蛍光顕微鏡は、動的流動条件下での細胞接着を支配するメカニズムを調べるために平行プレートフローチャンバーアッセイと結合することができる。例えば、複数のフルオロフォアで標識された癌細胞は、癌転移のメカニズムをモデル化するために潜在的に反応性の基板上に灌流することができる。しかしながら、リアルタイムの生細胞分析のための画像取得におけるマルチチャネル単一カメラシステムとカラーカメラの欠点を呈する。これらの制限を克服するために、我々は同時に、フローチャンバー内の蛍光標識された細胞のリアルタイム画像シーケンスをキャプチャするために、デュアルカメラ発光分割システムを使用した。デュアルカメラ発光分割システムフィルタ定義された波長は、それによって、同時に2つの空間的に同一であるが、フルオロフォア固有の画像を取り込む2のモノクロCCDカメラ、にわたる。続いて、1チャンネルの画像を単一に統合されpsuedocoloredリアルタイムは、関心領域を横切って急速に移動する細胞上の複数の標的分子を明らかにすることができる配列をマージ。

パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイは、同時に2つの発光チャネル（ 図1）内のリアルタイム画像シーケンスをキャプチャし、デュアルカメラ放出分割システムを実証するために使用した。デュアルカメラの排出分割システムは、蛍光抗ヒトCD24およびHECA-452（シアロフコシル化抗原を検出する）モノクローナル抗体および適切な二次抗体（ 図2）で標識し?...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

同時にデュアルカメラエミッション分割システムを使用して、2つの発光チャンネルにリアルタイム画像のキャプチャ：アプリケーションは、接着性を細胞する

二色蛍光顕微鏡用のデュアルカメラ発光分割システムは、優れた光学的および時間的解像度、パラレルプレートフローチャンバー接着アッセイを含む特定の生細胞アッセイの要件にリアルタイム画像シーケンスを生成する。ソフトウェアは同時に取得放出チャネルからの画像を合成するために使用された場合、疑似色画像シーケンスが生成される。

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Research

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