Name: simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke dr. Douglas Goetz (Institutt for kjemisk og biomolekylære Engineering, Ohio University) og Dr. Fabian Benencia (Department of Biomedical Sciences, Ohio University) for innsiktsfulle diskusjoner og manuskript vurdering. Vi vil også takke Dr. Christopher Huppenbauer for nyttige tekniske diskusjoner (W. Nuhsbaum Inc.). Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Foundation (cbet-1106118) og National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

En. Installasjon av programvare <ol><li> Kjøp StreamPix 5 Multi-Camera programvare med SimulPix modul eller annen bildebehandlingsprogrammer i stand til å samle og kombinere bilder tatt av svart-hvitt CCD-kameraer. </li><li> Minimumskrav for StreamPix 5 inkluderer: En PC som er utstyrt med Core 2 Duo med 2,4 GHz eller bedre med 2 GB RAM eller høyere. En støttet IEEE digitalt eller analogt kamera og kompatibel ramme fanget. Windows XP/7/Vista 32 eller 64 bit. En skjerm som støtter oppløsningen 1024 x 768 eller h?...

<ol>
	<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).</li><li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=carcinoma+cell+glycolipids,+integrins,+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow.">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li><li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions.">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li><li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands.">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li><li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion:+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces.">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li><li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow:+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion.">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li><li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions.">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li><li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells:+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways?.">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?.</a> Front. Oncol. 2, 103 (2012).</li><li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Importance+of+Titrating+Antibodies+for+Immunocytochemical+Methods.">The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2001).</li><li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells.">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li><li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules.">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li><li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development.">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li><li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system:+a+custom+technology+platform+for+high-speed,+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses.">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li><li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions.">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li><li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

Den doble kamera utslipp splitting systemet har romlig, tidsmessig, og optisk oppløsning som trengs for å ta bilder av høy kvalitet i applikasjoner der celle eller molekylær bevegelse er rask. I generere representative resultater, parametrene i to kamera utslipp splitting systemet, inkludert programvareinnstillinger og kamerainnstillinger, ble optimalisert for å få en sammenslått bildesekvens der rullende og heftende celler var romlig og tidsmessig justert. Dette optimalisering trinnet er kritisk, som forskyvning...

Metoder for analyse av molekyler på celleoverflaten, slik som farging, anvende prober som er kjemisk konjugert til fluoroforer, slik at deteksjon av målmolekyler. Live-cell imaging og hydrodynamiske strømningsbaserte celle adhesjon analysene er vanligvis spilt med monokrom CCD-kameraer er laget for å fange fysiologiske prosesser på celle og / eller molekylært nivå 1, 2. Disse kameraene er svært sensitive, levere rask bildefrekvens (større enn 30 bilder per sekund), og har en enestående tidsmessig oppløsning (på grunn av rask bildefrekvens og tider kort eksponering). Imidlertid kan monokrome kameraer bare fange et enkelt utslipp kanal (oppdage en eneste fluoroforen) for å samle inn bilder. Enkelt kamera utslippsknusesystemer kan innarbeides for å fange opp flere utslippskanaler, men ofte redusere synsfeltet og krever samme eksponeringstid for avbilding av alle kanaler. For å fange opp hele fargespekteret fra celler merket med flerfasele fluoroforer, et fargekamera kan brukes som et alternativ. Men fargekameraer er vanligvis ikke i stand til å gi tidsmessig oppløsning ønskelig for live cell imaging i enkelte programmer. En annen bildeenhet er nødvendig for applikasjoner der det er fordelaktig å avbilde levende celler på flere bølgelengder og samtidig beholde en høy tidsoppløsning. En førsteklasses eksperimentell anvendelse er den parallelle platen strømningskammeret adhesjon assay, hvor cellene er perfundert på fysiologisk relevante betingelser over en potensielt reaktiv substrat 1, 3. Celler i strømnings som uttrykker spesifikke celleoverflatemolekyler kan feste seg og rulle på underlaget, for eksempel en celle monolag uttrykker adhesjonsmolekyler eller overflate adsorbert ekstracellulære matriksproteiner 4, 5. Rullende celler kan gjennomgå roterende og translatorisk bevegelse i brøkdeler av et sekund. Molekylære egenskaper for rullende og adherente celler, slik som klynger av celleoverflate-molekyler, har også den potenal gjennomgå aktive omstilling på celleoverflaten. Dermed må bildesystemer gi en eksepsjonell tidsmessig oppløsning (30 bilder per sekund eller mer og &quot;nær null&quot; eksponeringstider) for å generere en bildesekvens som illustrerer steg-for-steg progresjon av celle rullende 6, 7. Dual kamera utslipps splitting systemer er i stand til å møte disse kravene for bildebehandling celler merket med flere fluorophores. Dual kamera utslipps splitting systemer splittet og filter fluorescens kanaler i to lignende kameraer å samtidig fange to romlig identiske men fluoroforpar spesifikke bilder samtidig som du beholder full synsfelt. Denne teknologien muliggjør direkte sammenligning av bildet som fanges i sanntid i hver kanal, og gjør det mulig for brukeren å raskt bytte mellom kameramodeller med ulike imaging evner. Denne funksjonen er nyttig for å gjøre justeringer i bildefotografering innstillinger i ett kamera som bedre at systemet skal fange oppfluoroforene med ulik intensitet, levetid, og ekstinksjonskoeffisienter åtte. Sammen med bildebehandlingsprogrammer, dual kamera utslipps splitting systemer tillater sanntids opptak av live-cell imaging-analyser på flere bølgelengder og kan forbedre in vitro analyser som bruker fluorescens å studere celle atferd.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Flerfarge immunfluorescens mikroskopi for å påvise spesifikke molekyler i cellemembranen kan være kombinert med parallelle plate strømningskammeret analyser for å undersøke mekanismer som styrer celleadhesjon under dynamiske strømningsbetingelser. For eksempel, kan kreftceller merket med flere fluoroforene bli perfused over en potensielt reaktive substrat å modellere mekanismer for kreft metastasering. Men flerkanals enkelt kamera systemer og fargekameraer utstillingen mangler i bildet oppkjøpet for sanntids levende celle analyse. For å overvinne disse begrensninger, har vi brukt et to kamera utslipp splitting system for å samtidig fange opp sanntidsbildesekvenser av fluorescensmerkede celler i strømningskammeret. Dual kamera utslipps splitting systemer filter definert bølgelengde varierer i to monokrom CCD-kameraer, og dermed samtidig fange to romlig identiske men fluoroforpar spesifikke bilder. Deretter blir psuedocolored ett-kanal bilder sammen til ettsanntid fusjonert sekvens som kan avsløre flere målmolekyler på celler beveger seg raskt over et område av interesse.

En parallell plate gjennomstrømningskammeret adhesjon assay ble anvendt for å demonstrere en to kamera utslipp splitting system som samtidig tatt sanntidsbildesekvenser i to utslippskanaler (figur 1). De to kamera utslipps splitting system detektert BT-20-celler som ble fluorescensmerkede med anti-human CD24-og HECA-452 (detektering sialofucosylated antigener) monoklonale antistoffer og egnede sekundære antistoffer (figur 2). Noen rullende celler viste røde signaler (CD24) ennå ikk...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion at JoVE.com

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Samtidig Fange sanntidsbilder i to utslippskanalen med en Dual Camera Emission Splitting System: Søknader til celle adhesjon

Dual kamera utslipps splitting systemer for to-farge fluorescens mikros generere sanntid bildesekvenser med eksepsjonell optisk og tidsmessig oppløsning, et krav i visse levende celle-analyser inkludert parallelle plate flyt kammer vedheft analyser. Når programvaren er ansatt for å slå sammen bilder fra samtidig kjøpt utslipps kanaler, er pseudocolored bildesekvenser produsert.

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Study of Cell Migration i microfabricated Kanaler

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching plattform for applikasjoner i celler og vev mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Ved hjelp av Cell-substrat Impedans og Live Cell Imaging å måle sanntid Endringer i Cellular Grep og De-adhesjon indusert av Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungekreft celler ved hjelp av en Multichannel Dual-elektrisk-felt microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Sanntidsovervåking av Intracellulær gallesyre Dynamics Ved hjelp av en genetisk kodet FRET baserte gallesyre Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Håndholdt klinisk Photoacoustic tenkelig System for sanntid ikke-invasiv liten dyr Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

En protokoll for sanntids 3D enkelt partikkel sporing

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

To metoder for Decellularization av anlegget vev for Tissue Engineering programmer

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Mikroskopi for Real-Time bestemmelse av single-celle morfologi i Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...