Name: simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Douglas Goetz (Institutionen för kemi-och biomolekylär Engineering, Ohio University) och Dr Fabian Benencia (Institutionen för biomedicin, Ohio University) för insiktsfulla diskussioner och manuskript översyn. Vi tackar också Dr Christopher Huppenbauer för hjälp tekniska diskussioner (W. Nuhsbaum Inc.). Detta arbete har finansierats med bidrag från National Science Foundation (CBET-1.106.118) och National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

1. Installation av programvara <ol><li> Köp StreamPix 5 Multi-kamera programvara med SimulPix modul eller annat bildbehandlingsprogram kan samla och kombinera bilder som tagits med monokroma CCD-kameror. </li><li> Minimikrav för StreamPix 5 är: En dator utrustad med Core 2 Duo med 2,4 GHz eller bättre med 2 GB RAM eller mer. En som stöds IEEE digital eller analog kamera och kompatibel frame grabber. Windows XP/7/Vista 32 eller 64 bit. En bildskärm som stöder upplösningen 1024 x 768 eller högre. Ett grafikkort...

<ol>
	<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).</li><li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mac-2+binding+protein+is+a+novel+e-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells.">Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44529 (2012).</li><li>Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=carcinoma+cell+glycolipids,+integrins,+and+other+glycoproteins+mediate+adhesion+to+HUVECs+under+flow.">carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284 (4), C977-C987 (2003).</li><li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions.">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J. Biol. Chem. 283 (23), 15816-15824 (2008).</li><li>Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+expressed+on+breast+cancer+cells+are+E-selectin+ligands.">Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 406 (3), 423-429 (2011).</li><li>Tees, D. F., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+adhesion:+an+exquisite+balance+of+hydrodynamic+and+molecular+forces.">Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces.</a> News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).</li><li>Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+diagram+for+cell+adhesion+under+flow:+leukocyte+rolling+and+firm+adhesion.">The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11262-11267 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li><li>Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HECA-452+is+a+non-function+blocking+antibody+for+isolated+sialyl+Lewis+x+adhesion+to+endothelial+expressed+E-selectin+under+flow+conditions.">HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions.</a> J. Immunol. Methods. 384 (1-2), 43-50 (2012).</li><li>Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+E-selectin+ligands+on+circulating+tumor+cells:+cross-regulation+with+cancer+stem+cell+regulatory+pathways?.">Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways?.</a> Front. Oncol. 2, 103 (2012).</li><li>Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Importance+of+Titrating+Antibodies+for+Immunocytochemical+Methods.">The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2001).</li><li>Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+electrophysiological+mapping+of+stem+cells.">In vitro electrophysiological mapping of stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).</li><li>Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+carbonyl+clusters+containing+labile+ligands+hyperstabilize+microtubules.">Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (6), 1116-1122 (2009).</li><li>Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+fluorescence+microscopy+for+imaging+the+dynamics+of+embryonic+development.">Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development.</a> HFSP J. 2 (3), 143-155 (2008).</li><li>Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system:+a+custom+technology+platform+for+high-speed,+multicolor+tissue+imaging+of+immune+responses.">Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).</li><li>Worth, D. C., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+imaging+cell-matrix+adhesions.">Advances in imaging cell-matrix adhesions.</a> J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).</li><li>Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

Den dubbla kamera utsläpp splitsystemet har den rumsliga, tidsmässiga, och optisk upplösning som behövs för att fånga bilder av hög kvalitet i applikationer där cell-eller molekylär rörelse är snabb. I generera representativa resultat, parametrar i dubbla dela systemkamera utsläpp, inklusive mjukvaruinställningar och kamerainställningar, har optimerats för att få en sammanslagna bildsekvens där valsning och vidhäftande celler var rumsligt och tidsmässigt linje. Denna optimering steg är kritisk, efter...

Metoder för analys av molekyler på cellytan, såsom immunfärgning, använda prober som är kemiskt konjugerade med fluoroforer, vilket möjliggör detektion av målmolekyler. Levande cell imaging och hydrodynamiska flödesbaserad celladhesionsanalyser är vanligtvis spelas med monokrom CCD-kameror är utformade för att fånga fysiologiska processer på cellulär och / eller molekylär nivå 1, 2. Dessa kameror är mycket känsliga, levererar snabb bildhastighet (mer än 30 bilder per sekund), och ger exceptionell tidsupplösning (på grund av snabb bildhastighet och korta exponeringstider). Däremot kan monokroma kameror bara fånga en enda utsläppskanal (upptäcka en enda fluorofor) för att samla in bilder. Enstaka kamera utsläpp delningssystem kan införlivas för att fånga flera utsläppskanaler men ofta minska synfältet och kräver samma exponeringstid för avbildning alla kanaler. För att fånga den fulla färgspektrum från celler märkta med multiple fluoroforer, en färgkamera kan användas som ett alternativ. Emellertid färgkameror är i allmänhet inte i stånd att tillhandahålla den temporala upplösningen som önskas för levande cell imaging i vissa applikationer. En annan bildenhet behövs för tillämpningar där det är fördelaktigt att bilden levande celler vid flera våglängder samtidigt behålla en hög tidsupplösning. Ett främsta experimentell tillämpning är den parallella plattflödeskammaren vidhäftningsanalys, där celler perfunderades vid fysiologiskt relevanta förhållanden under en potentiellt reaktiva substrat 1, 3. Celler i flödet som uttrycker specifika molekyler på cellytan kan vidhäfta och rulle på substratet, såsom en cellmonoskikt som uttrycker adhesionsmolekyler eller yt-adsorberat extracellulära matrisproteiner 4, 5. Rullande celler kan genomgå roterande och translationsrörelse i bråkdelar av en sekund. Molekylära funktionerna hos valsning och vidhäftande celler, såsom kluster av molekyler på cellytan, har också den potentioal genomgå aktiv omorganisation på cellytan. Således måste bildsystem ger en exceptionell tidsupplösning (30 bilder per sekund eller mer och &quot;nära noll&quot; exponeringstider) för att generera en bildsekvens som illustrerar steg-för-steg progression av cell rullande 6, 7. Delningssystem Dubbla kamera utsläpp kan uppfylla dessa krav för att avbilda celler märkta med flera fluoroforer. Delningssystem Dubbla kamera utsläpps split och filter fluorescens-kanaler i två liknande kameror att samtidigt fånga två rumsligt identiska men fluoroforenheter specifika bilder och samtidigt behålla hela synfältet. Denna teknik möjliggör direkt jämförelse av bilden fångas i realtid i varje kanal och gör det möjligt för användaren att snabbt växla mellan olika kameramodeller med olika bildfunktioner. Denna funktion är användbart för att göra justeringar av bildimportkonfigurationer i en kamera som bättre tillåta systemet att fångafluoroforer med olika intensitet, livslängder och extinktionskoefficienterna 8. Tillsammans med bildbehandlingsprogram, dubbla kamera delningssystem utsläpps tillåter realtidsinspelning av levande cell imaging analyser i flera våglängder och kan öka in vitro-analyser som använder fluorescens för att studera cellens beteende.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Multi-color immunfluorescensmikroskopi för att detektera specifika molekyler i cellmembranet kan kopplas med parallella plattflödeskammare analyser för att undersöka mekanismerna som reglerar cellvidhäftning under dynamiska flödesbetingelser. Till exempel kan cancerceller märkta med multipla fluoroforer perfuseras över en potentiellt reaktiva substrat för att modellera mekanismen av cancermetastaser. Men flera kanaler enda kamerasystem och färgkameror uppvisar brister i bild förvärv för realtids levande cell analys. För att övervinna dessa begränsningar, använde vi en dubbel kamera utsläpp splitsystem att samtidigt fånga realtidsbildsekvenser av fluorescerande celler i flödet kammaren. Dubbla kamera delningssystem utsläppsfilter definierade våglängdsområden i två monokrom CCD-kameror, och därmed samtidigt fånga två rumsligt identiska men fluoroforenheter specifika bilder. Därefter psuedocolored en kana bilderna kombineras till en endarealtid fusione sekvens som kan avslöja flera målmolekyler på celler som rör sig snabbt över en region av intresse.

En parallell platta flöde kammare vidhäftnings analys användes för att demonstrera en dubbel delning systemkamera utsläpp som samtidigt fångade realtidsbildsekvenser i två utsläppskanalerna (figur 1). Den dubbla kamera utsläpp splitsystem upptäckt BT-20 celler som fluorescerande med anti-humant CD24 och HECA-452 (upptäcka sialofucosylated antigener) monoklonala antikroppar och lämpliga sekundära antikroppar (Figur 2). Vissa rullande celler uppvisade röda signaler (CD24) ä...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion at JoVE.com

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Samtidigt Fånga bilder i realtid i två Utsläpps Kanaler Med hjälp av en Dual Camera Emission Splitting System: Ansökningar till Cell Adhesion

Dubbla kamera delningssystem för tvåfärgad fluorescensmikroskopi utsläpps generera realtidsbildsekvenser med exceptionell optisk och tidsmässig upplösning, ett krav för vissa levande cellanalyser inklusive parallella platta flöde kammare vidhäftningsanalyser. När programvaran används för att sammanfoga bilder samtidigt förvärvade utsläppskanaler, är pseudocolored bildsekvenser produceras.

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Studie av cellmigration i Mikrofabricerade kanaler

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching plattform för tillämpningar inom cell-och vävnads mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Använda Cell-substrat Impedans och levande cell imaging att mäta Realtids Förändringar i Cellular Adhesion och De-vidhäftning inducerad av Matrix Ändring

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

Electrotaxis Studier av lungcancerceller med användning av en Multichannel dubbla elektriskt fält mikroflödes Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Realtidsövervakning av intracellulär Bile Acid Dynamics hjälp av en genetiskt kodad FRET-baserade Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Handhållna kliniska Photoacoustic Imaging System för realtid noninvasiv små djur Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Ett protokoll för realtid 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Två metoder för Decellularization av växt vävnader för Tissue Engineering program

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ Mikroskopi för real tids bestämning av encellig morfologi i bioprocesser

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...