Name: three-dimensional confocal analysis of microglia/macrophage markers of polarization in experimental brain injury
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00
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스테파노 Fumagalli는 Monzino 재단의 동료입니다.

1. 면역 형광 다음의 프로토콜은 (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 식힌 50ml의 뒤에 PBS 20 ㎖, 0.1 몰 / 리터, pH가 7.4,) transcardially 관류 된 마우스로부터 얻은 뇌 관상 저온부에서 수행된다. 살포 후, 두뇌는 신중하게 제거하고 cryoprotection위한 4 ° C에서 하룻밤 PBS의 30 % 자당에 전송. 유리 병에 밀봉하여 -70 ° C에서 사용할 때까지에 저장되기 전에 3 분 동안 45 ° C - 뇌는 다음 빠르게에...

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+in+stroke:+therapeutic+targets.">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li><li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma.">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li><li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment.">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373 (2007).</li><li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype.">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943 (2011).</li><li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages.">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li><li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury.">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li></ol>

우리는 여기에서 허혈 영역 (더 자세한 분석을 위해 심판 6 참조)에 M / M 표현형 마커의 현지화 및 공동 발현을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 초점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 세 가지 차원 공 촛점 이미징 M / M 활성화의 관련 마커의 특정 염색을 결합한다. 항체, 혈청 희석 작업을 fluorconjugated의 미세 조정은 조사 마커 잡음 비율로 최?...

급성 뇌 손상 후, 미세 아교 세포가 빠르게 활성화 극적인 형태 적 형질 1-3을 변경 받아야합니다. 이 내장 함수는 응답은 부상 뇌 실질 4.5으로 마이그레이션 혈액 태생의 대 식세포의 모집에 연결되어 있습니다. 항원 적으로 구별되지 않는 미세 아교 세포 및 대식 세포의 역할은 뇌 손상에서 여전히 논의된다 (이제부터 M / M라고한다). 연구의 증가는 유사 주변 식세포에 대해 설명한 것과, 미세 아교 세포와 뇌가 대식 세포는 그 극단 (M1) 고전적인 염증성 독성이나 항 염증 보호 (M2) 표현형에 해당하는 서로 다른 표현형을 가정 할 수 모집을 나타냅니다. 프로 또는 항 염증 인자의 분비를 포함하여 다른 활성 상태는, 신경 영양 분자와 리소좀의 활동 자료는 그 발현 시간에 따라 표현형 마커의 특정 패턴을 특징으로한다주변 환경의 진화. 손상된 뇌의 이러한 M / M의 표현형의 특성은 여전히​​ 빈약하다. 우리는 뇌졸중 후 M / M 발현과 진화를 분석하는 pMCAo의 잘 확립 된 쥐 모델을 사용했다. 여기에 제시된 면역 형광 기반의 프로토콜은 특정 M / M 표현형 마커, 현지화 및 허혈성 지역에서 휴대 공동 식의 모양에 대한 통찰력을 얻기를 목표로하고 있습니다. 우리는 다른 활성화 상태 또는 표현형에 관련된 몇 가지 분자를 조사, 즉 CD11b를, 백혈구 및 M / M의 활성화 / 모집 6-8의 널리 사용되는 마커로 표시되는 표면 마커 CD68 리소좀 6,7 및 YM1 분비의 마커 단백질을 선택적으로 활성화 (M2) 대 식세포에 의해 표현 및 복구 기능 복원 9-10에 관련된. 두 개의 마커가 동일한 셀에 의해,하지만 서로 다른 세포 내 구획으로 표현 될 때, 혼자 colocalization을 많이 INF하지 않을 수 있습니다ormative. 이 경우, 동시 발현의 분석은 하나의 평면 뷰를 사용하여 입체 렌더링에서 수행 될 수있다. 우리는 여기에서 마커 동시 발현의 철저한 입체 분석을 얻기 위해 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat Anti-mouse CD11b</td>
			<td>Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat Anti-mouse CD68 </td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA 1957</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rabbit Anti-mouse Ym1 </td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>1404</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)</td>
			<td>CHEMICON</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biotinilated Goat Anti-Rat antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-065-143</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TSA Cyanine 5 System </td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL705A001KT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Prolong Gold </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-rat alexa 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11081</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti mouse Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vectors Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tritin X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat CM1850</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Olympus IX81 confocal microscope </td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AnalySIS software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaris software 5.0</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Photoshop cs2</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software packages GraphPad Prism version 4.0</td>
			<td>GraphPad Software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

three-dimensional confocal analysis of microglia/macrophage markers of polarization in experimental brain injury

뇌 스트로크 미세 아교 세포 / 대 식세포 후 (M / M)가 새로운 표면 항원의 발현 및 축적되어 염증 반응을 유지하는 매개체의 생산을 포함 극적인 형태 및 표현형의 변화와 급속한 활성화를 받고있다. 신흥 증거는 M / M은 급성 뇌 손상 후 클래식 (M1) 염증성 또는 다른 항 염증 (M2) 활성화를 가정 할 수있다 높은 플라스틱 셀 있음을 나타냅니다. 그러나 부상 뇌의 M / M 표현형 마커 표현, 자신의 colocalization을 시간적 진화의 전체 특성은 아직 행방 불명입니다. 구체적으로는 M / M 활성화의 관련 마커를 염색 면역 프로토콜은 허혈성 뇌에서 수행 될 수있다. 여기에서 우리는 현지화와 같은 M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴을 조사 할 수있는 강력한 방법으로 세 가지 차원 공 촛점 분석 한 다음 면역 형광 기반의 프로토콜을 제시CD11b를, CD68, YM1, 중대 뇌동맥 (pMCAO)의 영구적 인 폐쇄에 의해 유도 된 국소 허혈의 마우스 모델에서. 오염 된 곳의 두 가지 차원의 분석은 각각의 마커가 정의 된 M / M의 형태에 관련된 및 허혈성 병변에 지정된 현지화를 가지고 있는지 알 수있다. M / M 표현형 마커의 공동 발현의 패턴은 허혈 영역에서 입체 공 촛점 이미징에 의해 평가 될 수있다. 이미지가 비쳐 영향을 최소화하고, 파장 중복을 피하기 위해 순차 주사 모드 (180 X 135 X 10 ㎛의 부피에 해당하는 10 ㎛ Z 축 및 0.23 μm의 스텝 사이즈) 정의 된 볼륨에서 취득 할 수있다. 이미지이어서 Imaris 소프트웨어에 의해 입체 렌더링을 얻기 위해 처리된다. 세 가지 차원 렌더링의 단단한보기는 세포의 클러스터에있는 마커 식의 정의를 할 수 있습니다. 우리는 M / M은 병변 사이트 및 TI의 위치에 따라, 표현형의 다수쪽으로 분화하는 능력을 가지고 있음을 보여나 부상 후.

라벨 프로토콜 및 공 촛점 인수는 허혈 영역으로 수행 될 때 얻어진 결과의 일례는도 1a 및도 1b에 도시되어있다. 획득 된 영상의 2 차원보기는 허혈 후 이십사시간에서 (A), 리소좀 마커 CD68 (녹색) 허혈성 핵심에 존재 비대 ameboid CD11b를 세포 (적색)로 표시되어 있음을 보여줍니다. 국경 지역에서 (B)는 CD11b 양성 세포는 둥근 세포 기관 및 CD68에 대한 긍정적 인 분...

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Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Research

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In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

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