Name: three-dimensional confocal analysis of microglia/macrophage markers of polarization in experimental brain injury
Uploaded: 2013-09-04T13:00:00
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Stefano Fumagalli é um companheiro da Fundação Monzino.

1. Imunofluorescência O protocolo seguinte é realizada em crio-secções cerebrais coronais, obtidos a partir de ratinhos transcardially perfundidos (20 ml de PBS, 0,1 mol / litro, pH 7,4, seguido por 50 ml de paraformaldeído 4% gelada em PBS). Após a perfusão, os cérebros foram cuidadosamente removidos e transferidos para 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante a noite para crioprotecção. Os cérebros são então rapidamente congelados por imersão em isopentano a - 45 ° C durante 3 ...

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Yenari, M. A., Kauppinen, T. M., Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+in+stroke:+therapeutic+targets.">Microglial activation in stroke: therapeutic targets.</a> Neurotherapeutics. 7, 378-391 (2010).</li><li>Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunology+of+stroke:+from+mechanisms+to+translation.">The immunology of stroke: from mechanisms to translation.</a> Nat. Med. 17, 796-808 (2011).</li><li>Jin, R., Yang, G., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mechanisms+in+ischemic+stroke:+role+of+inflammatory+cells.">Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 779-789 (2010).</li><li>Schilling, M., Besselmann, M., Muller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+phagocytic+activity+of+resident+microglia+over+hematogenous+macrophages+following+transient+focal+cerebral+ischemia:+an+investigation+using+green+fluorescent+protein+transgenic+bone+marrow+chimeric+mice.">Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice.</a> Exp. Neurol. 196, 290-297 (2005).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> Journal of Neuroinflammation. 8, 174-193 (2011).</li><li>Zanier, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+cord+blood+mesenchymal+stem+cells+protect+mice+brain+after+trauma.">Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect mice brain after trauma.</a> Crit. CareMed. 39 (11), 2501-2510 (2011).</li><li>Capone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+derived+cells+exert+a+neuroprotective+action+by+changing+the+ischemic+microenvironment.">Neurosphere derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.</a> PLoS ONE. 2, e373 (2007).</li><li>Bhatia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+ofalternatively+activated+phenotype.">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance ofalternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943 (2011).</li><li>Raes, G., Noel, W., Beschin, A., Brys, L., de Baetselier, P., Hassanzadeh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIZZ1+and+Ym+as+tools+to+discriminate+between+differentially+activated+macrophages.">FIZZ1 and Ym as tools to discriminate between differentially activated macrophages.</a> Dev. Immunol. 9, 151-159 (2002).</li><li>Gesuete, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+C1+inhibitor+in+brain+ischemic+injury.">Recombinant C1 inhibitor in brain ischemic injury.</a> Ann. Neurol. 66, 332-342 (2009).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophages plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122 (3), 787-795 (2012).</li></ol>

Apresentamos aqui protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional como uma abordagem poderosa para investigar a localização e co-expressão de marcadores do fenótipo M / M para a área isquêmica (para uma análise mais detalhada, ver ref 6). Este método combina a coloração específica de marcador relevante de activação M / M e um imagem confocal tridimensional. O ajuste fino de anticorpos no soro, e fluorconjugated diluições de trabalho permite melhor sinal-...

Após lesão cerebral aguda, microglia são rapidamente ativadas e passam por morfológica dramática e fenotípica muda 1-3. Esta resposta intrínseca está associada ao recrutamento de macrófagos nascido de sangue que migram para o parênquima cerebral 4,5 feridos. O papel da microglia e macrófagos que não são antigenicamente distintos (doravante referido como M / M) em lesão cerebral ainda é debatido. Um número crescente de estudos indicam que, à semelhança do que descrito para macrófagos periféricos, microglia e cérebro recrutados macrófagos pode assumir diferentes fenótipos cujos extremos correspondem ao clássico tóxico pró-inflamatória (M1) ou de protecção (M2) fenótipo anti-inflamatório. Os diferentes estados de activação, incluindo a secreção de factores pro-ou anti-inflamatórios, a libertação de moléculas neurotróficas e actividade lisossomal são caracterizadas por um padrão específico de marcadores fenotípicos, cuja expressão depende da temporaisevolução do ambiente circundante. A caracterização destes fenótipos M / M no cérebro feridos ainda é escasso. Nós usamos um modelo murino bem estabelecida de pMCAo para analisar a expressão M / M e evolução após o AVC. Protocolos de imunofluorescência base aqui apresentados visam a obtenção de uma visão sobre o aparecimento de marcadores específicos M / M fenótipo, sua localização e co-expressão celular na área isquêmica. Nós investigamos algumas moléculas associadas a diferentes estado de ativação ou fenótipo, ou seja, CD11b, um marcador de superfície expressa por leucócitos e um marcador amplamente utilizado de M / M ativação / recrutamento 6-8, CD68 um marcador de lisossomos 6,7 e Ym1 uma secreção proteína expressa pelo alternativamente ativados (M2) e macrófagos associados a recuperação e restauração da função 9-10. Quando dois marcadores são expressos pela mesma célula, mas em diferentes compartimentos subcelulares, colocalização si só pode não ser tanto informative. Neste caso, a análise de co-expressão pode ser realizada utilizando único plano e vista por representações tridimensionais. Nós aqui descrevemos um protocolo para obter uma análise do marcador co-expressão completa tridimensional.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat Anti-mouse CD11b</td>
			<td>Kindly provided by Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milan, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat Anti-mouse CD68 </td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA 1957</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rabbit Anti-mouse Ym1 </td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>1404</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>H21492</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse Anti-Neural Nuclei (NeuN)</td>
			<td>CHEMICON</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biotinilated Goat Anti-Rat antibody</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>112-065-143</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TSA Cyanine 5 System </td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL705A001KT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Prolong Gold </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-rat alexa 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11081</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti mouse Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vectors Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tritin X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat CM1850</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Olympus IX81 confocal microscope </td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AnalySIS software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaris software 5.0</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Photoshop cs2</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software packages GraphPad Prism version 4.0</td>
			<td>GraphPad Software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

three-dimensional confocal analysis of microglia/macrophage markers of polarization in experimental brain injury

Depois de acidente vascular cerebral microglia / macrófagos (M / M) sofrer ativação rápida, com alterações morfológicas e fenotípicas dramáticas que incluem expressão de antígenos de superfície novas e produção de mediadores que se formam e mantêm a resposta inflamatória. Algumas evidências indicam que M / M são células altamente plástico que pode assumir anti-inflamatória (M2) de activação pró-inflamatória (M1) ou alternativo clássico após lesão cerebral aguda. No entanto, uma caracterização completa de M / M expressão do marcador fenótipo, sua co-localização e evolução temporal no cérebro ferido ainda está desaparecida. Protocolos de coloração por imunofluorescência especificamente marcadores relevantes de activação M / M pode ser realizada no cérebro isquémico. Apresentamos aqui os protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional como uma abordagem poderosa para investigar o padrão de localização e de co-expressão de marcadores fenotípicos M / M, comoCD11b, CD68, Ym1, no modelo de rato de isquemia focal induzida por oclusão permanente da artéria cerebral média (pMCAO). Análise bidimensional da área manchada revela que cada marcador é associado a uma morfologia M / M definido e tem uma dada localização na lesão isquémica. Padrões de M / M fenótipo marcador co-expressão pode ser avaliada por imagem confocal tridimensional na área isquémica. As imagens podem ser adquiridos ao longo de um volume definido (10 m z-eixo e um tamanho de 0,23 mM passo, o que corresponde a um volume de 180 x 135 x 10 mm) com um modo de varrimento sequencial para minimizar os efeitos de passagem de purga e de evitar a sobreposição de comprimento de onda. As imagens são, então, processado para obter representações tridimensionais, por meio de software Imaris. Visão sólida de três representações tridimensionais permite a definição de expressão do marcador em grupos de células. Nós mostramos que M / M têm a capacidade de se diferenciar para uma multiplicidade de fenótipos, dependendo da localização do local da lesão e time após a lesão.

Um exemplo dos resultados obtidos quando os protocolos de rotulagem e aquisições confocal são realizadas na região isquémica é ilustrado nas Figuras 1A e 1B. Uma vista bidimensional de imagens adquiridas mostra que, em vinte e quatro horas após a isquemia (D), o marcador CD68 lisossomal (verde) é expresso em células hipertróficas amebóides CD11b (vermelho) presentes no núcleo isquémico. Na zona de fronteira células positivas (B) CD11b exib...

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Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

Uma maneira de ganhar novos insights sobre a complexidade da resposta inflamatória do cérebro é apresentado. Descrevemos protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional para investigar o padrão de co-expressão de marcadores fenotípicos microglia / macrófagos em um modelo de rato de isquemia focal.

Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurociência

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