Name: a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells
Uploaded: 2013-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Michael Chou, Bingbing Dai, e Liang Xiao per contribuire dati per questo manoscritto. Riconosciamo anche il Dr. John Gray per i doni generosi di reagenti utilizzati in questo studio. PB è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dal National Cancer Center. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 e RCA170820A), una borsa di studio dalla Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation, una borsa di accelerazione traslazionale dal Centro comune di Medicina Traslazionale e di una sovvenzione da parte del California HIV / AIDS programma di ricerca.

DC-LV cellule produttori stabili sono costruite sulla base della confezione cella linea 11 GPR che contiene la necessaria componenti lentivirale gagpol, rev e il sistema tet-off. Prima, trasduzione retrovirale viene utilizzato per generare una linea cellulare di packaging GPRS che codifica un tet-dipendente SVGmu glicoproteina. Poi, concatemer matrice trasfezione è usato per trasfettare la linea cellulare GPRS con un vettore lentivirale come transgene GFP. Questa linea cellulare stabile produttore, ...

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	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genotoxic+potential+of+retroviral+vectors+is+strongly+modulated+by+vector+design+and+integration+site+selection+in+a+mouse+model+of+HSC+gene+therapy.">The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy.</a> J. Clin. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

Qui, abbiamo delineato un metodo per la produzione di grandi quantità di vettori lentivirali utilizzando 293T cellule trasdotte stabilmente con tutti i componenti lentivirali sotto il tet off sistema di regolamentazione. Ad oggi, la maggior parte dei protocolli per produrre vettori lentivirali basano su standard di trasfezione transiente di calcio fosfato (cfr. 18, per esempio). Questo approccio ha avuto successo su scala clinico, ma può soffrire di alcune limitazioni che possono non essere presenti in scal...

Molti sistemi vettore sono stati sviluppati per il trasferimento genico. Vettori basati su lentivirus sono stati tra il sistema virale più comunemente studiate. Questi vettori sono vantaggiose perché possono trasdurre efficientemente sia divisione e non divisione delle cellule 1, ottenere l&#39;espressione a lungo termine a causa di integrazione nel genoma dell&#39;ospite, mostrare bassa immunità anti-vettore naturale nella maggior parte delle popolazioni umane 2, e hanno un basso potenziale di genotossicità di mutagenesi inserzionale 3,4. Produzione di lentivirus è sempre stata colorata da preoccupazioni di sicurezza. Vettori lentivirali derivano generalmente da HIV-1, l&#39;agente eziologico dell&#39;AIDS. Trasfezione transiente dei singoli componenti del lentivector (trasferimento, busta e plasmidi di imballaggio) è un mezzo comune e flessibile di fornire materiale genetico in laboratorio. Tuttavia, scaling-up transfezioni transitori per le applicazioni cliniche è ingombrante e may portare allo sviluppo di replicazione-competenti lentivirus 5,6. Per superare questi ostacoli, vari imballaggio stabile e linee cellulari di produttori sono state sviluppate 6-11. Una di queste linee, la linea di confezionamento GPR 11, ha il vantaggio di essere attraente regolato dalla tetraciclina. In questo lavoro, dimostriamo come adattare questo sistema per la produzione di auto-inattivanti vettori lentivirali che sono specificamente indirizzate verso le cellule dendritiche (DC-VL) 12. Le cellule dendritiche (DC) sono le più robuste cellule presentanti l&#39;antigene del sistema immunitario. Essi sono stati oggetto di grande interesse per lo sviluppo di vaccini cancro perché essi avviano direttamente, programmi, e regolano le risposte immunitarie tumore-specifici 13. Inserimento di un protocollo di vaccinazione per includere PVS ha il potenziale di provocare una risposta immunitaria antitumorale forte di peptide o DNA vaccini. Recentemente, abbiamo sviluppato un vettori lentivirali che specifically obiettivi di cellule dendritiche attraverso un Sindbis modificato virus glicoproteina, SVGmu 14. Questi vettori sono unici nel senso che mostrano elevata specificità per le cellule dendritiche e di generare risposte immunitarie più forti che non specifici, vettori VSVG-pseudotyped. Qui riportiamo un metodo per produrre grandi quantità di questi vettori lentivirali DC-mirati. Dimostriamo che questi DC-LV può infettare cellule dendritiche e generare forti CD8 + risposta immunitaria delle cellule T. Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti con umanità, con l&#39;approvazione della USC istituzionale dell&#39;Ateneo cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa. Per svolgere esperimenti in vivo e clinici, è fondamentale per creare una linea cellulare che può produrre virus ad un alto titolo. Di eseguire la procedura di trasduzione e trasfezione esattamente come descritto consentirà di massimizzare le probabilità di generare una tale clone.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

Vettori lentivirali (LV) sono un mezzo efficace per la fornitura di materiale genetico di molti tipi di cellule. A causa di problemi di sicurezza associati a questi HIV-1 vettori derivati, la produzione di grandi quantità di volumi logici è impegnativo. In questo lavoro, riportiamo un metodo per produrre alti titoli di LV auto-inattivanti. Abbiamo retrovirally trasdurre il tet-off stabile produttore cella linea GPR per generare una linea cellulare, GPRS, che può esprimere tutti i componenti virali, compresa una cellula dendritica glicoproteina-specifico, SVGmu. Poi usiamo trasfezione del DNA concatemeric trasfezione trasferimento plasmide codificante GFP LV un gene reporter in combinazione con un marcatore selezionabile. Molti dei cloni risultanti possono produrre LV ad un titolo 10 volte più grande di quello che otteniamo con trasfezione transiente. In più, questi virus efficientemente trasdurre cellule dendritiche in vitro e generano una cellula T forte risposta immunitaria all&#39;antigene nostra giornalista. Questo metodo può essere una buona opzione for la produzione di vaccini forti LV-based per gli studi clinici di cancro o di malattie infettive.

La linea cellulare stabile descritto nel presente metodo può produrre grandi quantità di vettori lentivirali mirati specificatamente alle cellule dendritiche. Come mostrato nella Figura 1B, isolamento di cloni individuali ha prodotto linee cellulari stabili di qualità variabile 12. Tra 26 cloni saggiati, 8 prodotte particelle lentivirali ad un titolo maggiore di 10 6 unità di trasduzione per ml (TU / ml), che è un punto di riferimento tipico per vettori lentivirali SVG-pseudot...

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A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Qui, usiamo trasduzione retrovirale e trasfezione concatemeric per creare una linea cellulare che può esprimere le componenti di un vettore lentivirale (LV) in assenza di tetraciclina. Questo LV codifica GFP ed è pseudotyped con una glicoproteina, SVGmu, che è specifico per un recettore sulle cellule dendritiche.

Una linea cellulare tetraciclina regolata produce vettori lentivirali ad alto titolo che si rivolgono specificamente cellule dendritiche

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

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