Name: a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells
Uploaded: 2013-06-19T13:00:00
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저자는이 원고에 대한 데이터를 기여 마이클 추, 빙빙 다이, 그리고 리앙 샤오를 인정하고 싶습니다. 우리는 또한이 연구에 사용 된 시약의 관대 선물 닥터 존 그레이을 인정합니다. PB는 국립 암 센터에서 박사 친교에 의해 지원됩니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소 (R01AI68978, P01CA132681 및 RCA170820A), 빌과 멜린다 게이츠 재단, 번역 의학 합동 센터에서 번역 가속 그랜트와 캘리포니아 HIV / AIDS에서 부여에서 부여에서 교부금에 의해 지원되었다 연구 프로그램.

DC-LV 안정적인 생산 세포는 필요한 렌티 바이러스 구성 요소 gagpol, 회전 및 TET 오프 시스템을 포함 GPR 포장 세포주 11에 따라 구성됩니다. 첫째, 레트로 바이러스 전달은 TET 의존 SVGmu 당 단백질을 인코딩 GPRS 포장 세포주를 생성하는 데 사용됩니다. 그런 다음, concatemer 배열 형질이 같은 GFP와 같은 렌티 바이러스 벡터 유전자와 GPRS 세포주를 형질하는 데 사용됩니다. LV-MGFP로 지정이 안...

<ol>
	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. 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여기, 우리는 안정적으로 규제 시스템의 전원 TET 아래의 모든 렌티 바이러스 구성 요소와 형질 293T 세포를 사용하여 렌티 바이러스 벡터의 대량 생산을위한 방법을 설명했다. 지금까지, 렌티 바이러스 벡터를 생산하는 대부분의 프로토콜 (예를 들어, 18 참조) 표준 인산 칼슘 일시적인 형질 전환에 의존하고 있습니다. 이 방법은 임상 척도에 성공했습니다,하지만 안정적인 세포 라인에서 ?...

많은 벡터 시스템은 유전자 전달을 위해 개발되었습니다. 렌티 바이러스에 기반 벡터는 가장 일반적으로 공부 바이러스 시스템 사이에 있었다. 그들이 효율적으로 세포 1 분할 및 비 나누어 모두 형질 도입으로 인해 호스트 게놈에 통합 장기적인 표현을 달성, 대부분의 인간 집단이 낮은 천연 안티 - 벡터 내성을 전시하고, 대한 낮은 가능성을 가질 수 있기 때문에 이러한 벡터 유익하다 insertional 돌연변이 3,4에서 유전 독성. 렌티 바이러스의 생산은 항상 안전에 대한 우려로 채색되어 있습니다. 렌티 바이러스 벡터는 일반적으로 HIV-1, AIDS의 원인균 에이전트에서 파생됩니다. lentivector의 개별 구성 요소 (전송, 봉투, 포장 플라스미드)의 일시적인 형질 실험실 설정에서 유전 물질을 전달하는 일반적이고 유연한 방법입니다. 그러나 임상 응용을위한 확장까지 과도의 transfections는 복잡하고 엄마입니다y를 복제 능력 렌티 5,6의 발전으로 이어질. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 몇몇 안정 포장 및 생산 세포주는 6-11 개발되었다. 이 라인 중 하나 GPR 포장 라인 (11)은 테트라 사이클린에 의해 규제되는 매력적인 장점이 있습니다. 본 논문에서, 우리는 구체적으로 돌기 세포 (DC-정맥 주사) 12를 대상으로하는 자체 운영을 중지시키지 렌티 바이러스 벡터를 생산하는이 시스템을 적용하는 방법을 보여줍니다. 돌기 세포 (DCS)는 면역 시스템의 가장 강력한 항원 제시 세포입니다. 그들이 직접 프로그램을 시작하고, 종양 특이 면역 반응하기 13 규제 때문에 그들은 암 백신 개발에 큰 관심의 대상이되고있다. DC의 펩타이드 또는 DNA 백신보다 더 강력한 항암 면역 반응을 유도 할 수있는 잠재력을 포함하는 예방 접종 프로토콜을 통합. 최근에, 우리는 렌티 바이러스 벡터를 개발 한 specifically를 수정 sindbis 바이러스 당 단백질, SVGmu 14을 통해 수지상 세포를 대상으로합니다. 그들은 돌기 세포에 높은 특이성을 보여 비특이적, VSVg-pseudotyped 벡터보다 강한 면역 반응을 생성하는 이러한 벡터는 고유합니다. 여기, 우리는이 DC-타겟 렌티 바이러스 벡터의 대량 생산을위한 방법을보고합니다. 우리는이 DC-LV를이 수지상 세포를 감염하고 강력한 CD8 + T 세포의 면역 반응을 생성 할 수 보여줍니다. 동물과 관련된 모든 절차는 USC Intitutional 동물 관리 및 사용위원회의 승인에 따라 인도적으로 수행되었다. 생체 및 임상 실험을 수행하기 위해서는, 그것은 높은 역가에 바이러스를 생성 할 수 세포 라인을 만드는 것이 중요합니다. 설명대로 전달과 형질 전환 단계를 수행하면 이러한 복제를 생성하는 기회를 극대화하는 것입니다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

렌티 바이러스 벡터 (정맥 주사)는 세포의 여러 유형에 유전 물질을 전달하는 강력한 수단입니다. 정맥 주사의 대량 생산이 HIV-1 유래 벡터와 관련된 안전 문제 때문에하는 것은 도전이다. 본 논문에서, 우리는 자기 불활 정맥 주사의 높은 역가를 생산하는 방법을보고합니다. 우리는 retrovirally 돌기 세포 특정 당 단백질, SVGmu 포함한 모든 바이러스 구성 요소를 표현할 수있는 세포주, GPRS를, 생성하는 TET 오프 안정적인 생산 세포주 GPR를​​ 형질 도입. 다음, 우리는 LV 전송 플라스미드 인코딩에게 선택 마커와 함께 리포터 유전자 GFP를 형질을 concatemeric DNA의 형질 전환을 사용합니다. 결과 클론 중 일부는 우리가 일시적인 형질로 얻을 수있는 것보다 10 배 더 큰 역가에 LV를 생성 할 수 있습니다. 또한, 이러한 바이러스를 효율적으로 체외에서 수지상 세포를 형질 도입하고 기자 항원에 강한 T 세포 면역 반응을 생성합니다. 이 방법은 좋은 옵션을 구경 할 수 있습니다R 암 또는 감염성 질환의 임상 연구에 대한 강력한 LV-기반의 백신을 생산.

이 방법에서 설명하는 안정적인 세포 라인은 특히 돌기 세포를 대상으로하는 렌티 바이러스 벡터의 대량 생성 할 수 있습니다. 그림 1B에서 보는 바와 같이, 각각의 클론의 분리 품질 12 변화의 안정적인 세포 라인을 굴복. 테스트 26 클론 중 8 일시적인 형질 전환에 의해 생산 SVG-pseudotyped 렌티 바이러스 벡터에 대한 일반적인 벤치 마크 ML (TU / ML), 당보다 큰 10 6 전달 단?...

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A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

리보플라빈과 혈소판 제품 및 자외선 치료 : 높은 역가 세균 오염에 대해 효과

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

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Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

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개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...