Name: a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells
Uploaded: 2013-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Michael Chou, Bingbing Dai, og Liang Xiao for å bidra data for dette manuskriptet. Vi erkjenner også Dr. John Gray for de sjenerøse gaver av reagenser som brukes i denne studien. PB er støttet av en postdoktorstilling fra National Cancer Center. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 og RCA170820A), et stipend fra Bill og Melinda Gates Foundation, en translasjonell akselerasjon stipend fra Joint Center for translasjonell medisin og et stipend fra California HIV / AIDS Research Program.

DC-LV stabile produsent-celler som er konstruert basert på den GPR emballasjen cellelinje 11 som inneholder de nødvendige komponenter lentiviral gagpol, Rev og Tet-off-system. Først blir retroviral transduksjon brukes til å generere en GPRS emballasje cellelinje som koder for et tet-avhengige SVGmu glykoprotein. Deretter er concatemer rekke transfeksjon brukes til transfektere GPRS cellelinje med en lentiviral vektor transgene som GFP. Denne stabile produsent-cellelinje, betegnet som LV-MGFP, kan...

<ol>
	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genotoxic+potential+of+retroviral+vectors+is+strongly+modulated+by+vector+design+and+integration+site+selection+in+a+mouse+model+of+HSC+gene+therapy.">The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).</li><li>Hu, B., Tai, A., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+delivered+by+lentiviral+vectors+for+cancer+and+infectious+diseases.">Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases.</a> Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).</li><li>Broussau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).</li><li>Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trans-lentiviral+packaging+cell+line+for+high-titer+conditional+self-inactivating+HIV-1+vectors.">A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-titer+HIV-1+vector+production.">Continuous high-titer HIV-1 vector production.</a> Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).</li><li>Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+packaging+cell+line+for+lentivirus+vectors.">A packaging cell line for lentivirus vectors.</a> Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).</li><li>Strang, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+vectors+with+alphavirus+envelope+glycoproteins+produced+from+stable+packaging+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells.</a> Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).</li><li>Throm, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection.">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li><li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination.">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449, 419-426 (2007).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+lentivector+targeting+of+dendritic+cells+for+in+vivo+immunization.">Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization.</a> Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).</li><li>Hanawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+rhesus+repopulating+hematopoietic+stem+cells+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vector+system.">Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system.</a> Blood. 103, 4062-4069 (2004).</li><li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells.">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).</li><li>Dai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag-specific+immunity+induced+by+a+lentivector-based+vaccine+directed+to+dendritic+cells.">HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Grade+Lentiviral+Vectors.">Clinical Grade Lentiviral Vectors.</a> Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).</li><li>Loew, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+PG13-based+packaging+cell+line+for+stable+production+of+clinical-grade+self-inactivating+gamma-retroviral+vectors+using+targeted+integration.">A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration.</a> Gene Ther. 17, 272-280 (2010).</li><li>Gaspar, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

Her har vi skissert en metode for å produsere store mengder lentiviral vektorer ved hjelp 293T celler stabilt transduced med alle lentiviral komponentene under tet utenfor regelverket. Til dags dato, de fleste protokoller for å produsere lentiviral vektorer stole på standard kalsiumfosfat transient transfeksjon (se 18, for eksempel). Denne tilnærmingen har vært vellykket på en klinisk skala, men det kan lide noen begrensninger ikke sannsynlig å være til stede i skalere opp produksjonen fra stabile cel...

Mange vektor systemer har blitt utviklet for genet levering. Vektorer basert på lentiviruses har vært blant de mest studerte viral system. Disse vektorer er fordelaktig fordi de effektivt kan transduce både delende og ikke-delende celler 1, for å oppnå langvarig ekspresjon på grunn av integrering i vertsgenomet, utviser lav naturlig anti-vektor immunitet i de fleste humane populasjoner 2, og har et lavt potensial for gentoksisitet fra innsettingen mutagenese 3,4. Produksjon av lentiviruses har alltid vært farget av sikkerhetsmessige hensyn. Lentiviral vektorer er generelt avledet fra HIV-1, det etiologiske middel for AIDS. Forbigående transfeksjon av enkelte komponentene i lentivector (overføring, konvolutt og emballasje plasmider) er en vanlig og fleksibel måte å levere genetisk materiale i laboratoriet. Imidlertid er oppskalering forbigående transfections for kliniske applikasjoner tungvint og may føre til utvikling av replikering-kompetente lentivirus 5,6. For å overvinne disse hindringene, har flere stabile emballasje og produsent cellelinjer blitt utviklet 6-11. En av disse linjene, GPR pakkelinjen 11, har den fordelen av å være attraktive regulert av tetracyklin. I denne artikkelen viser vi hvordan du kan tilpasse dette systemet til å produsere selv-inaktivere lentiviral vektorer som er spesielt rettet mot dendrittiske celler (DC-LVS) 12. Dendrittiske celler (DCS) er de mest robuste antigenpresenterende celler i immunsystemet. De har vært gjenstand for stor interesse i kreft vaksineutvikling fordi de direkte initiere, program og regulere tumor-spesifikke immunresponser 13. Består av et vaksinasjon protokollen til å inkludere DCs har potensial til å lokke fram en sterkere antitumor immunrespons enn peptid eller DNA-vaksiner. Nylig har vi utviklet en lentiviral vektor som specifically mål dendrittiske celler gjennom en modifisert sindbis virus glykoprotein, 14 SVGmu. Disse vektorer er unike ved at de viser høy spesifisitet til dendrittiske celler og generere sterkere immunresponser enn uspesifikke, VSVg-pseudotyped vektorer. Her rapporterer en metode for fremstilling av store mengder av disse DC-målrettede lentiviral vektorer. Vi viser at disse DC-LVS kan infisere DCs og generere sterke CD8 + T-celle immunrespons. Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført humant, under godkjenning av USC Intitutional Animal Care og bruk Committee. For å utføre in vivo eksperimenter og klinisk, er det avgjørende for å skape en cellelinje som kan produsere virus i høy titer og. Utføre transduksjon og transfeksjon skritt nøyaktig som beskrevet vil maksimere sjansene for å generere en slik klone.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

Lentiviral vektorer (LVS) er et kraftig middel til å levere genetisk materiale til mange typer celler. På grunn av sikkerhetsmessige bekymringer knyttet til disse HIV-1 avledet vektorer, som produserer store mengder LVS er utfordrende. I denne artikkelen rapporterer vi en metode for å produsere høy titer av selv-inaktivere LVS. Vi retrovirally transduce Tet-off stabil produsent cellelinje GPR å generere en cellelinje, GPRS, som kan uttrykke alle de virale komponenter, inkludert en dendrittiske celle-spesifikk glykoprotein, SVGmu. Deretter bruker vi concatemeric DNA transfeksjon å transfektere LV overføring plasmid koding en reporter gen GFP i kombinasjon med en valgbar markør. Flere av de resulterende klonene kan produsere LV ved en titer 10 ganger høyere enn hva vi oppnå med forbigående transfeksjon. I tillegg er disse virusene effektivt transduce dendrittiske celler in vitro og generere en sterk T-celle immunrespons mot vår reporter antigen. Denne metoden kan være et godt alternativ for fremstilling av sterke LV-baserte vaksiner for kliniske studier av cancer eller smittsomme sykdommer.

Den stabile cellelinje som er beskrevet i denne fremgangsmåte kan produsere store mengder lentiviral vektorer som er spesielt rettet til dendrittiske celler. Som vist i figur 1B, ga isolasjon av individuelle kloner stabile cellelinjer av varierende kvalitet 12. Blant de 26 kloner som ble testet, produserte 8 lentiviral partikler ved en titer på mer enn 10 6 transduksjon enheter pr ml (TU / ml), noe som er en typisk standard for SVG-pseudotyped lentiviral vektorer produsert ved fo...

Watch this Scientific Journal Video about A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells at JoVE.com

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Her anvendes retroviral transduksjon og concatemeric transfeksjon for å skape en cellelinje som kan uttrykke komponentene i en lentiviral vektor (LV) i fravær av tetracyklin. Dette LV koder GFP og er pseudotyped med et glykoprotein, SVGmu, som er spesifikk for en reseptor på dendrittiske celler.

En Tetracyclin-regulert Cell Linje Produserer Høy titer lentiviral vektorer som spesifikt retter dendrittiske celler

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Generering av en ny dendritisk cellevaksine ved hjelp av melanom og squamous kreft stamceller

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Behandling av blodplater Produkter med Riboflavin og UV Light: Effektivitet mot høye Titer bakteriell forurensning

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Generering av umoden, moden og tolerogene dendrittiske celler med ulik Metabolsk fenotyper

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

En lettvinte protokoll for å generere Site-Specifically Acetylated proteiner i Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Utvikling og validering av en Ultrasensitive ett molekyl Array Digital enzym knyttet Immunosorbent analysen for menneskelig Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...