Name: a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells
Uploaded: 2013-06-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Чоу, Бингбинг Дай, и Лян Сяо за вклад данных для данной рукописи. Мы также признаем, доктор Джон Грей за щедрые дары реагенты, используемые в этом исследовании. PB поддерживается докторской стипендии от Национального онкологического центра. Это исследование было поддержано грантами от Национального института здоровья (R01AI68978, P01CA132681 и RCA170820A), грант от Фонда Билла и Мелинды Гейтс, грант поступательное ускорение от Объединенного центра Поступательное медицины и грант от Калифорнии ВИЧ / СПИД исследовательской программы.

DC-LV стабильные клетки производителей построены на основе ячейки GPR упаковочной линии 11, которая содержит необходимые компоненты лентивирусный gagpol, оборот и Тет-офф системы. Во-первых, ретровирусной трансдукции используется для генерации клетки GPRS упаковочной линии, которая...

<ol>
	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+transfer+in+a+tumor-prone+mouse+model+uncovers+low+genotoxicity+of+lentiviral+vector+integration.">Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration.</a> Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).</li><li>Montini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genotoxic+potential+of+retroviral+vectors+is+strongly+modulated+by+vector+design+and+integration+site+selection+in+a+mouse+model+of+HSC+gene+therapy.">The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).</li><li>Hu, B., Tai, A., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+delivered+by+lentiviral+vectors+for+cancer+and+infectious+diseases.">Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases.</a> Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).</li><li>Broussau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+packaging+cells+for+large-scale+production+of+lentiviral+vectors+in+serum-free+suspension+culture.">Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).</li><li>Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trans-lentiviral+packaging+cell+line+for+high-titer+conditional+self-inactivating+HIV-1+vectors.">A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).</li><li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-titer+HIV-1+vector+production.">Continuous high-titer HIV-1 vector production.</a> Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).</li><li>Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+packaging+cell+line+for+lentivirus+vectors.">A packaging cell line for lentivirus vectors.</a> Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).</li><li>Strang, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+vectors+with+alphavirus+envelope+glycoproteins+produced+from+stable+packaging+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells.</a> Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).</li><li>Throm, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection.">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li><li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination.">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449, 419-426 (2007).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+lentivector+targeting+of+dendritic+cells+for+in+vivo+immunization.">Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization.</a> Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).</li><li>Hanawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+rhesus+repopulating+hematopoietic+stem+cells+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vector+system.">Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system.</a> Blood. 103, 4062-4069 (2004).</li><li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells.">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).</li><li>Dai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag-specific+immunity+induced+by+a+lentivector-based+vaccine+directed+to+dendritic+cells.">HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Grade+Lentiviral+Vectors.">Clinical Grade Lentiviral Vectors.</a> Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).</li><li>Loew, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+PG13-based+packaging+cell+line+for+stable+production+of+clinical-grade+self-inactivating+gamma-retroviral+vectors+using+targeted+integration.">A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration.</a> Gene Ther. 17, 272-280 (2010).</li><li>Gaspar, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

Здесь мы выделили способ получения больших количеств лентивирусных векторов использованием клеток 293Т стабильно трансдуцированных все лентивирусов компонентов в соответствии с тет от системы регулирования. На сегодняшний день большинство протоколов для производства лентивирусных...

Многие системы вектор были разработаны для доставки генов. Векторов на основе лентивирусы были одними из наиболее часто изучаются вирусная системы. Эти векторы выгодно, потому что они могут эффективно преобразовывать как деления и не делящиеся клетки 1, достижения долгосрочного выражение благодаря интеграции в геном хозяина, проявляют низкую природные анти-вектора иммунитета в большинстве человеческих популяций 2, и имеют низкий потенциал генотоксичностью от 3,4 инсерционного мутагенеза. Производство лентивирусы всегда было окрашено безопасности. Лентивирусов векторов обычно получают из ВИЧ-1, этиологический агент СПИДа. Переходные трансфекции отдельных компонентов lentivector (передача, конверт и упаковку плазмид) является общим и гибким средством доставки генетического материала в лабораторных условиях. Тем не менее, расширение деятельности временных трансфекций для клинического применения является громоздкой и мау приводить к развитию к репликации лентивирусов 5,6. Чтобы преодолеть эти препятствия, несколько устойчивых линий упаковки и производителя клетки были разработаны 6-11. Одна из этих линий, линия упаковки GPR 11, имеет привлекательное преимущество, что они регулируются тетрациклина. В этой работе показано, как приспособить эту систему для получения самостоятельного инактивации лентивирусных векторов, которые специально ориентирована на дендритные клетки (DC-ПЗ) 12. Дендритные клетки (ДК) являются наиболее надежными антигенпрезентирующих клетках иммунной системы. Они были предметом большой интерес в развитии рака вакцины, поскольку они непосредственно инициировать, программа, и регулируют опухоль-специфического иммунного ответа 13. Включение вакцинации протокола включить ДК имеет потенциал, чтобы вызвать более сильный противоопухолевый иммунный ответ, чем пептид или ДНК-вакцин. Недавно мы разработали лентивирусный вектор, который specificallу цели дендритные клетки через изменение гликопротеина вируса Синдбис, SVGmu 14. Эти векторы уникальны тем, что они показывают высокую специфичность в дендритные клетки и генерировать сильный иммунный ответ, чем неспецифические, VSVG-pseudotyped векторов. Мы сообщаем способ получения больших количеств этих DC-целевых лентивирусов векторов. Мы показываем, что эти DC-Lys может заразить ДК и генерируют сильные CD8 + Т-клеточный иммунный ответ. Все процедуры, связанные с животных были проведены гуманно, с одобрения USC Intitutional уходу и использованию животных комитета. Для того, чтобы выполнить в естественных условиях и клинические эксперименты, очень важно, чтобы создать линию клеток, которая может производить вирус на высоком титре. Выполнение трансдукции и трансфекции шаги в точности так, как описано максимизирует вероятность получения такого клона.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

Лентивирусов векторов (LV) являются мощным средством доставки генетического материала для многих типов клеток. В целях безопасности, связанные с этими ВИЧ-1, полученных векторов, производя большое количество ракет-носителей является сложной задачей. В данной работе мы сообщаем о первом способе получения высоких титров самостоятельно инактивирующий ЛВС. Мы трансдукции ретровирусом тет-офф стабильной клеточной линии производитель GPR для получения линии клеток, GPRS, который может экспрессировать все вирусные компоненты, в том числе дендритных клеток специфический гликопротеин, SVGmu. Затем мы используем concatemeric трансфекции ДНК для трансфекции передачи LV плазмиды, кодирующей репортерный ген GFP в комбинации с селективным маркером. Некоторые из полученных клонов может производить LV с титром 10 раз больше, чем то, что мы достигаем с временной трансфекции. Кроме того, эти вирусы эффективно трансдукции дендритных клеток в пробирке и генерировать сильный Т-клеточный иммунный ответ на наш репортер антигена. Этот метод может быть хорошим недопустимая кодировкат производстве сильный LV вакцины на основе клинических исследований рака или инфекционных заболеваний.

Стабильной клеточной линии описаны в этот метод может производить большое количество лентивирусных векторов, которые специально предназначены для дендритных клеток. Как показано на фиг.1В, выделение индивидуальных клонов дали стабильных клеточных линий различного качества...

Watch this Scientific Journal Video about A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells at JoVE.com

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Здесь мы используем ретровирусной трансдукции и concatemeric трансфекции создать клеточную линию, которая может выразить компоненты лентивирусов вектор (LV) в отсутствие тетрациклина. Этот LV кодирующий GFP и pseudotyped с гликопротеином, SVGmu, которая является специфической для рецептором на дендритных клеток.

Тетрациклин-регулируемой клеточная линия продуцирует высоким титром лентивирусных векторов, которые специально направлены дендритных клеток

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Расширение цитотоксических Т-лимфоцитов из пуповинной крови, что целевая цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр Вирус, и аденовирус

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Магнитно-резонансная томография

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Поколение новой дендритно-клеточной вакцины с использованием меланомы и плоскоклеточных раковых стволовых клеток

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Лечение тромбоцитов Продукты с рибофлавин и УФ света: эффективность против высокий титр бактериального загрязнения

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Поколение незрелые, зрелые и толерогенную дендритных клеток с отличающимися метаболический фенотипов

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Разработка и валидация сверхчувствительная одной молекулы массив цифровых энзим соединенный Assay иммуносорбента для человеческий интерферон α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...