Name: a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells
Uploaded: 2013-06-19T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Michael Chou, Bingbing Dai, y Liang Xiao para aportar datos de este manuscrito. También se agradece al Dr. John Gray por las generosas donaciones de los reactivos utilizados en este estudio. PB es apoyado por una beca postdoctoral del Centro Nacional del Cáncer. Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de Salud (R01AI68978, P01CA132681 y RCA170820A), una subvención de la Fundación Bill y Melinda Gates, una subvención aceleración traslacional del Centro Conjunto para la Medicina Traslacional y una subvención de la epidemia de VIH / SIDA de California Programa de Investigación.

DC-LV células productoras estables se construyen sobre la base de la línea de envasado 11 células GPR que contiene los componentes necesarios lentiviral gagpol, rev y el sistema tet-off. En primer lugar, la transducción retroviral se utiliza para generar una línea celular de empaquetamiento GPRS que codifica una glicoproteína SVGmu tet-dependiente. Entonces, concatemer array transfección se utilizó para transfectar la línea celular GPRS con un vector lentiviral transgén como GFP. Esta líne...

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	<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li><li>Kootstra, N. A., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+with+viral+vectors.">Gene therapy with viral vectors.</a> Annu. Rev. Pharmacol. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+producer+cell+lines+for+a+SIN+lentiviral+vector+for+SCID-X1+gene+therapy+by+concatemeric+array+transfection.">Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection.</a> Blood. 113, 5104-5110 (2009).</li><li>Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+stable+producer+cells+to+make+high-titer+lentiviral+vectors+for+dendritic+cell-based+vaccination.">Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).</li><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449, 419-426 (2007).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+lentivector+targeting+of+dendritic+cells+for+in+vivo+immunization.">Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization.</a> Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).</li><li>Hanawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+rhesus+repopulating+hematopoietic+stem+cells+using+a+simian+immunodeficiency+virus-based+lentiviral+vector+system.">Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system.</a> Blood. 103, 4062-4069 (2004).</li><li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells.">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).</li><li>Dai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Gag-specific+immunity+induced+by+a+lentivector-based+vaccine+directed+to+dendritic+cells.">HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+use+of+a+pseudotyped+gammaretroviral+vector.">Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector.</a> Lancet. 364, 2181-2187 (2004).</li><li>Cornetta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+lentivirus+analysis+of+clinical+grade+vector+products.">Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products.</a> Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).</li><li>Stewart, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+producer+cell+line+for+the+manufacture+of+a+lentiviral+vector+for+gene+therapy+of+Parkinson's+disease.">A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson's disease.</a> Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).</li><li>Coroadinha, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+producer+cell+line+metabolism:+implications+on+viral+productivity.">Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).</li></ol>

Aquí, hemos esbozado un método para producir grandes cantidades de vectores lentiviral utilizando células 293T transducidas establemente con todos los componentes de lentivirus bajo el tet fuera del sistema regulatorio. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos para producir vectores lentivirales se basan en fosfato de calcio transfección transitoria estándar (ver 18, por ejemplo). Este enfoque ha tenido éxito a nivel clínico, pero puede sufrir de algunas limitaciones que no puedan estar presentes ...

Muchos sistemas de vectores se han desarrollado para la entrega de genes. Los vectores basados ​​en lentivirus han estado entre el sistema viral más comúnmente estudiada. Estos vectores son ventajosas, ya que pueden transducir eficientemente tanto que se dividen y no se dividen las células 1, conseguir la expresión a largo plazo debido a la integración en el genoma huésped, exhibir una baja inmunidad anti-vector natural en la mayoría de las poblaciones humanas 2, y tienen un bajo potencial de genotoxicidad de mutagénesis de inserción 3,4. Producción de lentivirus siempre ha sido coloreado por las preocupaciones de seguridad. Los vectores lentivirales se derivan generalmente de VIH-1, el agente etiológico del SIDA. La transfección transitoria de los componentes individuales de la lentivirus (transferencia, sobre, y los plásmidos de embalaje) es un medio común y flexible de la entrega de material genético en el laboratorio. Sin embargo, la ampliación de las transfecciones transitorias para la aplicación clínica es engorroso y may conducir al desarrollo de lentivirus con capacidad de replicación 5,6. Para superar estos obstáculos, varios envases estable y líneas celulares productoras se han desarrollado 6-11. Una de estas líneas, la línea de envasado GPR 11, tiene la ventaja de ser atractivo regulado por tetraciclina. En este trabajo se demuestra cómo adaptar este sistema para producir auto-inactivación de vectores lentiviral que se dirigen específicamente a las células dendríticas (DC-LV) 12. Las células dendríticas (DC) son las más robustas células presentadoras de antígenos del sistema inmune. Han sido objeto de gran interés en el desarrollo de vacuna contra el cáncer, ya que inician directamente, programa, y regulan las respuestas inmunes específicas de tumor 13. La incorporación de un protocolo de vacunación para incluir a los DC tiene el potencial de provocar una respuesta inmune antitumoral más fuerte que las vacunas de péptidos o ADN. Recientemente, se ha desarrollado un vector lentiviral que specifically dirige a las células dendríticas a través de una glicoproteína del virus de Sindbis modificado, SVGmu 14. Estos vectores son únicos en cuanto a que muestran una alta especificidad para células dendríticas y generan respuestas inmunes más fuertes que los vectores no específicos, VSVG-pseudotyped. Aquí, se presenta un método para la producción de grandes cantidades de estos vectores lentiviral DC-dirigidos. Se demuestra que estos DC-LV puede infectar a los DC y generar fuertes T CD8 + respuestas inmunes celulares. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo con humanidad, en virtud de la aprobación de la USC Intitutional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Para llevar a cabo experimentos in vivo y clínica, es fundamental para crear una línea de células que pueden producir virus en una alta concentración. Realización de las etapas de transducción y transfección exactamente como se describe será maximizar las posibilidades de la generación de dicho clon.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Mediatech Inc.</td>
			<td>25-005-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Clontech Laboratories, Inc.</td>
			<td>631311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R250-01</td>
			<td>Toxic</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a tetracycline-regulated cell line produces high-titer lentiviral vectors that specifically target dendritic cells

Los vectores lentivirales (LVs) son un poderoso medio de la entrega de material genético a muchos tipos de células. Debido a los problemas de seguridad asociados a estas VIH-1 vectores derivados, produciendo grandes cantidades de LV es un reto. En este trabajo se presenta un método para la producción de títulos elevados de LV libre inactivar. Nos retroviral transducir la Tet-Off productor estable la línea celular GPR para generar una línea celular, GPRS, que pueden expresar todos los componentes virales, incluyendo una glicoproteína específica de célula dendrítica, SVGmu. A continuación, utilizamos la transfección de ADN concatemeric para transfectar el plásmido que codifica la transferencia de LV un gen reportero GFP en combinación con un marcador seleccionable. Varios de los clones resultantes pueden producir LV a un título 10 veces mayor que lo que logramos con transfección transitoria. Además, estos virus transducen eficazmente células dendríticas in vitro y generan una fuerte respuesta inmune de células T a nuestra antígeno reportero. Este método puede ser una buena opción FOr produciendo fuertes LV vacunas basadas en los estudios clínicos de cáncer o enfermedades infecciosas.

La línea celular estable descrito en este método puede producir grandes cantidades de vectores lentivirales que están dirigidos específicamente a las células dendríticas. Como se muestra en la Figura 1B, el aislamiento de clones individuales produjo líneas celulares estables de calidad variable 12. Entre 26 clones ensayados, 8 produce partículas lentivirales a un título mayor de 10 6 unidades de transducción por ml (UT / ml), que es un punto de referencia típica para los...

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A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Aquí, nosotros usamos la transducción retroviral y transfección concatemeric para crear una línea de células que pueden expresar las componentes de un vector lentiviral (VI) en ausencia de tetraciclina. Esta LV codifica GFP y se pseudotyped con una glicoproteína, SVGmu, que es específico para un receptor en las células dendríticas.

Una línea celular regulada por tetraciclina Produce lentiviral vectores de alta titulación que se dirigen específicamente a las células dendríticas

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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